生物制药工艺学
第一章 生物药物概述
1、我国药物的三大药源指的是化学药物 、生物药物 、中草药 。
2、现代生物药物已形成四大类型，包括基因工程药物、 基因药物 、 天然生物药物 、 医学生物制品 。
3、 药物 、生物药物、生物制品
药物：
用于预防、治疗或诊断疾病或调节机体生理功能、促进机体康复保健的物质，有4大类：预防药、治疗药、诊断药和康复保健药。
生物药物：
是利用生物体、生物组织、细胞或其成分，综合应用生物与医学、生物化学与分子生物学、微生物学与免疫学、物理化学与工程学和药学的原理与方法进行加工、制造而成的一大类预防、诊断、治疗和康复保健的制品。
广义：
从动物、植物、微生物和海洋生物为原料等制取的各种天然生物活性物质以及人工合成或半合成的天然物质类似物；还包括生物工程技术制造生产的新生物技术药物。
医学生物制品：
一般指：用微生物（包括细菌、噬菌体、立克次体、病毒等）、微生物代谢产物、动物毒素、人或动物的血液或组织等加工制成的预防、治疗和诊断特定传染病或其它有关疾病的免疫制剂，主要指菌苗、疫苗、毒素、应变原与血液制品等。
《新生物制品审批办法》生物制品定义：
是应用普通的或以基因工程 、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备的，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。
4、 生化药物、微生物药物
生化药物：
指从生物体（动物、植物、和微生物中获得的天然存在的生化活性物质（或者合成、半合成的天然物质类似物），其有效成分和化学本质多数比较清楚，通常按其化学本质和药理作用分类命名。
微生物药物：
是一类特异的天然有机化合物，包括微生物的初级代谢产物、次级代谢产物和微生物结构物质，还包括借助微生物转化产生的药物或中间体。
5、 基因重组药物与基因药物有什么区别？
基因重组药物属于基因工程药物，这类药物主要是应用基因工程和蛋白质工程技术制造的重组活性多肽、蛋白质及其修饰物。而基因药物不是基因工程药物，这类药物是以基因物质（RNA或DNA及其衍生物）作为治疗的物质基础，包括基因治疗用的重组目的DNA片段、重组疫苗、反义药物和核酶等。
6、 生物药物有哪些作用特点？（生物药物的特性）
（一）药理学特性：
1、活性强: 体内存在的天然活性物质。
2、治疗针对性强,基于生理生化机制。
3、毒副作用一般较少，营养价值高。
4、生理副作用常有发生可能具免疫原性或产生过敏反应。
(二)、理化特性：
1.生物材料中有效成分浓度低，杂质种类多且含量相对较高
2.生物活性物质组成结构复杂、稳定性差
3.生物材料易染菌、腐败
4.生物药物制剂的特殊要求：缓释、控释
第二章 生物制药工艺技术基础
1、生化活性物质浓缩可采用的方法有盐析浓缩 、 有机溶剂沉淀浓缩 、 用葡聚糖凝胶浓缩 、用聚乙二醇透析浓缩 、 超滤浓缩 、真空减压浓缩与薄膜浓缩 。
2、生化活性物质常用的干燥方法有 减压干燥 、 喷雾干燥 、 冷冻干燥 等。
3、冷冻干燥是在 低温 、 低压 条件下，利用水的 升华 性能而进行的一种干燥方法。
4、固定化酶常采用的方法可分为 吸附法 、 包埋法 、 交联法 和 共价键结合法 四大类。
选择题：
5、由于目的蛋白质和杂蛋白分子量差别较大，拟根据分子量大小分离纯化并获得目的蛋白质，可采用 （ C ）
q A、SDS凝胶电泳 B、盐析法 C、凝胶过滤 D、吸附层析
6、分离纯化早期，由于提取液中成分复杂，目的物浓度稀，因而易采用 （ A ）
q A、分离量大分辨率低的方法 B、分离量小分辨率低的方法
q C、分离量小分辨率高的方法 D、各种方法都试验一下，根据试验结果确定
7、 简述生物活性物质分离纯化的主要原理。
（1）据分子形状和大小：
差速离心与超离心、膜分离（透析，电渗析）与超滤，凝胶过滤法。
（2） 据分子电离性质的差异性：
离子交换法，电泳法，等电聚集法。
（3）据分子极性大小及溶解度不同：
溶剂提取法，盐析法，等电点沉淀法及有机溶剂分级沉淀法。
（4）据物质吸附性质的不同：
选择性吸附法与吸附层析法。
（5）据配体特异性进行分离：亲和层析法。
8、生化制药的六个阶段
（1）原料的选择和预处理
（2）原料的粉碎
（3）提取：从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗品的工艺过程。
（4）纯化：粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、 透析、超离心 、膜分离、结晶等步骤进行精制的工艺过程。
（5）浓缩、干燥及保存
（6）制剂：原料药（精制品）经精细加工制成片剂、针剂、冻干剂、粉剂等供临床应用的各种剂型。
9、生物活性物质的来源及生物材料选择的质量准则
（一）生物活性物质的来源
l 动物脏器
l 血液、分泌物和其他代谢物
l 海洋生物
l 植物
l 微生物
l 开发生物新资源
（二）生物原料选择的质量准则：
n 有效成分含量高的新鲜材料；
n 来源丰富易得；
n 成本比较低；
n 杂质含量少
n 原料的采集不破坏生态环境, 对环境友好的原材料资源。
10、常用的活性物质提取的方法有哪些？
①酸、碱、盐水溶液提取方法 ②表面活性剂提取方法与反胶束提取方法 ③有机溶剂提取
④双水相萃取法 ⑤超临界萃取法
11、盐溶作用的原理？
在稀盐溶液中，盐离子作用于生物大分子表面，增加了表面电荷，使之极性增加，水合作用增强，促进形成稳定的双电层，对生物大分子起到助溶作用。
12、活性物质提取时的保护性措施哪些？
活性物质的保护措施：
（1）缓冲盐系统：防止pH大幅度变化
（2）保护剂：还原剂、酶的底物、金属鳌合剂
（3）抑制水解酶的作用
¡ 加EDTA除去重金属抑制酶活性
¡ 选择热变性,使蛋白酶变性
¡ 添加酶抑制剂
（4）其它保护措施（防过冷、过热、酸、碱、紫外线、搅拌、高频振荡等）
第三章 生物材料的预处理、细胞破碎和液-固分离
1.细胞培养液的预处理方法。（书P117-120）
1）细胞及蛋白质的处理
（1）加入凝聚剂
Al2(SO4)3·18H2O、AlCl3·6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3
（2）加入絮凝剂
q絮凝剂：有机高分子，易溶，链长，活性功能基团多
q影响因素：分子量、用量、pH、操作条件（搅拌）
（3）变性作用
（4）吸附
q加入吸附剂：活性碳除热原
q加入反应剂：相互作用形成沉淀吸附蛋白质
（5）加各种沉淀剂沉淀
2）.多糖的去除
3）.高价金属离子的去除
2.凝聚作用和絮凝作用的原理各是什么？
凝聚作用：指在某些电解质作用下，使胶体粒子的扩散双电层的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。
絮凝作用：当往胶体悬浮液中加入絮凝剂时，胶粒可强烈吸附在絮凝剂表面的功能团上，而且一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的颗粒的表面上，形成架桥联接，形成粗大的絮凝团沉淀出来，有助于过滤。
3.常用的细胞破碎方法有哪些？
一、机械法1、匀浆法 2、珠磨法 3、超声波
二、物理法1.干燥 2.冻融 3.渗透压冲击
三、化学法1.化学试剂处理 2.制成丙酮粉
四、生物法1.酶解法 2.自溶
4.固液分离方法有哪些？
1）过滤：常规和错流
2）离心分离：过滤式离心和沉降式离心
第四章 萃取法
1.掌握萃取与反萃取，分配系数与分配比，萃取比和萃取率，分离因素的概念。
（1）萃取：料液与萃取剂接触后，料液中的溶质向萃取剂转移的过程
（2）反萃取：将萃取液与反萃取剂（含无机酸或碱的水溶液或水）相接触，使某种被萃入有机相的溶质转入水相的过程。
（3）分配定律：一定温度、一定压力下，某一溶质在互不相溶的两种溶剂间分配时，达到平衡后；在两相中的活度之比为一常数，如果是稀溶液，可以用浓度代替活度，即：
K 称为分配系数。
（4）在萃取过程中，溶质在两相的分子形式常常并不相同，仍然采用类似分配定律的公式作为基本公式。这时候溶质在萃取相和萃余相中的浓度，以分配比表示。
分配比（D）：两相中各种化学形式进行分配的溶质总浓度的比值
K表示在特定的平衡条件下，被萃物在两相中的有效浓度（即分子形式一样）的比值；
D表示实际平衡条件下被萃物在两相中总浓度（即不管分子以什么形式存在）的比值。分配比随着萃取条件变化而改变。
（5）萃取因素：也称萃取比，指被萃取溶质进入萃取相的总量与该溶质在萃余相中总量之比。通常以E表示。
（6）萃取率：一种萃取剂对某种溶质的萃取能力（工业上用）
（7）分离因素：料液中的溶质并非是单一的组分，除了所需产物（A）外，还存在有杂质（B）。分离因素常用b表示，其定义为：在同一萃取体系内两种溶质在同样条件下分配系数的比值。值越大（或越小）分离效果越好，越接近于1，分离效果越差。
2.萃取的方法有哪些？
萃取按照操作方式分类：（一）单级萃取 （二）多级萃取（错流萃取和逆流萃取）
方法：溶剂萃取法、双水相萃取、反胶束萃取、超临界萃取
3.影响溶剂萃取的因素？
（1）、乳化和破乳化
（2）、pH的影响
（3）、温度和萃取时间的影响
（4）、盐析作用的影响
（5）、溶剂种类、用量及萃取方式的选择
4.萃取的步骤有哪些？
（1）、混合
（2）、液—液两相分离
（3）、离心萃取机
（4）、溶剂回收
（一）单组分溶剂回收：简单蒸馏或精馏
（二）低浓度溶剂回收：先简单蒸馏,后精馏
(三)回收与水部分互溶并形成恒沸混和物的溶剂
(四)回收完全互溶的混和溶剂并不形成恒沸混和物
5.双水相萃取、反胶束萃取、超临界流体萃取基本原理及各自的优点？
（1）双水相萃取：利用生物物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异进行分离的过程。
优点：保留产物的活性、可连续化操作
（2）反胶束萃取：
原理：表面活性剂溶于非极性溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度，便会在有机溶剂内形成聚集体，非极性基团在外，极性基团则排列在内，形成一个极性核，此极性核具有溶解极性物质的能力。当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质及其他亲水性物质能够溶于极性核内部的水中，由于周围的水层和极性基团的保护，蛋白质不与有机溶剂接触，从而不会造成失活。
反胶束萃取具有成本低、溶剂可反复使用、萃取率和反萃取率都高等突出的优点。
（3）超临界流体萃取
利用处于临界压力和临界温度以上的一些溶剂流体所具有特异增加物质溶解能力来分离纯化的技术。
当气体物质处于其临界温度(Tc)和临界压力(Pc)以上时，不会凝缩为液体，只是密度增大，具有许多特殊的物理化学性质：
q 流体的密度接近于液体的密度,
q 粘度接近于气体；
q 在临界点附近,超临界流体的溶解度对温度和压力的变化非常敏感；
优点: ①具有广泛的适应性：
②萃取效率高，过程易于调节：
③分离工艺流程简单：
④有些分离过程可在接近室温下完成
缺点：分离过程必须在高压下进行，设备及工艺技术要求高，投资比较大，普及应用较为困难。
6.什么是流体，利用CO2作为超临界萃取的优点
流体是液体和气体的总称。流体是由大量的、不断地作热运动而且无固定平衡位置的分子构成的，它的基本特征是没有一定的形状和具有流动性。
利用CO2作为萃取剂主要有以下优点:
(1) 二氧化碳超临界温度(Tc=31.06℃)是所有溶剂中最接近室温的，可以在35～40℃的条件下进行提取,防止热敏性物质的变质和挥发性物质的逸散。
(2)在CO2气体笼罩下进行萃取,萃取过程中不发生化学反应;又由于完全隔绝了空气中的氧,因此,萃取物不会因氧化或化学变化而变质。
(3)由于CO2无味、无臭、无毒、不可燃、价格便宜、纯度高、容易获得,使用相对安全。
(4)CO2是较容易提纯与分离的气体,因此萃取物几乎无溶剂残留,也避免了溶剂对人体的毒害和对环境的污染。
(5) CO2扩散系数大而粘度小,大大节省了萃取时间,萃取效率高。
7、破乳方法主要有哪些？
1）加表面活性剂：改变界面张力
2）离心：促进乳状液滴碰撞聚集
3）电解质：中和电荷，盐析蛋白质
4）加热：促液滴布朗运动增加，降低黏度
5）吸附：介质对油和水的吸附能力差异破乳
6）高压电：破坏双电层等
7）稀释：降低乳化剂浓度
8）其他：超滤、反应萃取、结合萃取剂和破乳剂的筛选
第五章 固相析出分离
1.固相析出法主要包括 盐析法 ， 有机溶剂沉淀法 ， 等电点沉淀法 ， 结晶法 及其它多种沉淀方法等。
2.按照一般的习惯，析出物为晶体时称为 结晶法 ，析出物为无定形固体则称为 沉淀法 。
3. KS盐析法、β盐析法
右下图示：盐离子浓度与蛋白质溶解度关系曲线，在盐析区，符合公式
logS=b-Ksm
S——蛋白质溶解度，g/L；m—盐离子强度；Ci——i离子浓度，mol/L；Zi——i离子化合价；
b——常数,为纵坐标上的截距;Ks——盐析常数
两种类型：
（1）在一定的pH和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析，称作Ks盐析法。
由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。
（2）在一定离子强度下仅改变pH和温度进行盐析，称作β盐析法。
由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，后期分离（结晶）。
4. 结晶包括三个过程：(1) 形成飽和溶液 ；(2) 晶核形成 ；(3) 晶体生长 。
5.晶体的质量主要是指 晶体的大小 、形状 和 纯度 等3个方面。
选择：
1、 在一定的pH和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析，称作 (A )
A．KS盐析法 B．β盐析法 C．重复盐析法 D．分部盐析法
2、盐析法与有机溶剂沉淀法比较，其优点是（ ）
A.分辨率高 B.变性作用小 C.杂质易除 D.沉淀易分离
3、 将配基与可溶性的载体偶联后形成载体-配基复合物，该复合物可选择性地与蛋白质结合，在一定条件下沉淀出来，此方法称为（ ）
A．亲和沉淀 B．聚合物沉淀 C．金属离子沉淀 D．盐析沉淀
4、影响晶体大小的主要因素与下列哪些因素无关 ( )
A．过饱和度 B．温度 C．搅拌速度 D．饱和度
思考题
1. 沉淀与结晶有何不同？常用的沉淀方法包括哪些？
结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出，形成新相的过程。
沉淀是溶液中难溶解的固体物质从溶液中析出的过程。
n 结晶法：析出物为晶体。
n 沉淀法：析出物为无定形固体。
沉淀方法：（1）有机溶剂沉淀法 （2）等电点沉淀 （3）成盐沉淀法
（4）亲和沉淀 （5）高分子聚合物沉淀法 （6）表面活性剂沉淀法
2 .何谓盐析？其原理是什么？常用的盐析方法有哪些？影响盐析的主要因素有哪些？盐析操作时常用的盐是什么？
（1）盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。
（2）原理：盐溶现象和盐析作用
盐析作用的原理是：
破坏双电层：在高盐溶液中，带大量电荷的盐离子能中和蛋白质表面的电荷，使蛋白质分子之间电排斥作用相互减弱而能相互聚集起来。
破坏水化层：中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀。
（3）影响盐析的因素
①无机盐的种类
盐析用盐的选择：盐析作用要强
盐析用盐需有较大的溶解度
盐析用盐必须是惰性的
来源丰富、经济
②溶质（蛋白质等）种类：Ks、β
③溶质（蛋白质等）浓度：2~3%
④温度
⑤pH
（4）盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠。
硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂
3 . 有机溶剂沉淀法的主要原理是什么？影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？
（1）主要机制：
①亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。
②水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。
以上两种因素相比较，脱水作用比静电作用强。
（2）影响沉淀效果的因素
①有机溶剂种类
沉淀用的有机溶剂的选择：
q能与水无限混溶
q介电常数小、沉淀强
q变性小
q毒性小，挥发性适中
②pH的影响
③温度
④无机盐的含量
⑤某些金属离子的助沉淀作用
⑥样品浓度
4. 什么是结晶？结晶过程包括哪些？在何种条件下，溶液中才有晶体析出？
（1）溶液中的溶质在一定条件下因分子有规则的排列而结合成晶体。结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出，形成新相的过程。
（2）过程：
n 形成过饱和溶液
n 晶核形成
n 晶体生长
（3）溶质只有在过饱和溶液中才能析出
条件：
推动力：形成新相（固体）需要一定的表面自由能。因此，溶液浓度达到饱和溶解度时，晶体尚不能析出，只有当溶质浓度超过饱和溶解度后，才可能有晶体析出。
晶核：最先析出的微小颗粒是以后晶体的中心，称为晶核。
首先形成晶核，由Kelvin公式，微小的晶核具有较大的溶解度。实质上，在饱和溶液中，晶核是处于一种形成—溶解—再形成的动态平衡之中，只有达到一定的过饱和度以后，晶核才能够稳定存在。
5. 提高晶体质量的途径
晶体质量包括三个方面的内容：晶体大小、形状和纯度
（1）晶体大小
1）过饱和度
过饱和度值应大至使结晶操作控制在亚稳区内，又保持较高的晶体生长速率，使结晶高产而优质。
2）温度（缓慢冷却）
3）搅拌速度：适当，不宜太快
4）晶种：诱导结晶，控制晶体形状大小均匀度
（2）晶体形状
n 控制晶体生长速度和结晶温度
n 控制过饱和度
n 选择不同的溶剂
n 调节溶液的pH
n 有目的地加入某种能改变晶形的杂质
（3）晶体纯度
杂质对晶体的成长速率的影响较为复杂，有的杂质能抑制晶体的成长，有的能促进成长，有的能改变晶型。
n 过滤分离母液中的杂质
n 晶体越细小，杂质越多
n 洗涤有利提高纯度
n 结晶速度过快，易产生“晶蔟”，包含杂质
（4）晶体结块
原因：粒度不齐、空气湿度高、温度高、受压、贮存时间增长
措施：控制粒度分布、良好外形、干燥密闭容器贮存
（5） 重结晶：晶体用合适溶剂溶解后再次结晶，提高纯度
第六章 吸附分离法
1、吸附剂按其化学结构可分为两大类：一类是有机吸附剂，如 活性炭 、 淀粉 、大孔吸附树脂等；另一类是无机吸附剂，如白陶土、 氧化铝 、 硅胶 、 硅藻土 等。
2、常用的吸附剂有 活性炭 、 硅胶 和 白陶土 等。
3、大孔网状聚合物吸附剂按骨架的极性强弱，可分为非极性、中等极性、极性和强极性吸附剂四类。
选择：
n1、用大网格高聚物吸附剂吸附的弱酸性物质，一般用下列哪种溶液洗脱 （ D ）
qA.水 B.高盐 C.低pH D. 高pH
n2、“类似物容易吸附类似物”的原则,一般极性吸附剂适宜于从何种溶剂中吸附极性物质（ B ）
qA.极性溶剂 B.非极性溶剂 C.水 D.溶剂
n3、活性炭在下列哪种溶剂中吸附能力最强？ （A）
q A.水 B.甲醇 C.乙醇 D.三氯甲烷
n 4、 关于大孔树脂洗脱条件的说法，错误的是：（A）
qA .最常用的是以高级醇、酮或其水溶液解吸。
qB. 对弱酸性物质可用碱来解吸。
qC. 对弱碱性物质可用酸来解吸。
qD.如吸附系在高浓度盐类溶液中进行时，则常常仅用水洗就能解吸下来。
问答：
1、吸附原理
吸附作用：
界面上的分子同时受到不相等的两相分子的作用力，界面分子的力场不饱和，即存在一种固体的表面力，能从外界吸附分子、原子或离子，并在吸附剂表面附近形成多分子层或单分子层。
2、大网格吸附剂及其吸附的特点
大孔网状吸附剂（大网格吸附剂)：
在树脂聚合时加入惰性的致孔剂，待网格骨架固化和链结构单元形成后，用溶剂萃取或蒸馏水洗将致孔剂去掉，形成不受外界环境条件影响的孔隙，其孔径远大于2～4nm，可达100nm，故称“大孔”。
特点：
①选择性好、解吸容易、理化性质稳定、机械强度好、可反复使用等优点。
②其孔隙大小、骨架结构和极性，可按照需要，根据不同的原料和合成条件而改变，因此可③适用于吸附各种有机化合物。
④适合弱电解质及非离子型化合物分离。
3、大网格吸附剂吸附的操作过程
⑴树脂选择
类似物容易吸附类似物
孔径：树脂孔径为溶质分子直径的6倍较宜
预处理：甲醇洗涤
再生：一种溶剂或多种溶剂清洗，甲醇、丙酮、乙酸乙酯
⑵吸附条件选择
pH影响离解程度，影响吸附量
无机盐：增大吸附量
⑶洗脱条件选择
最常用低级醇、酮或其水溶液解吸
解吸溶剂能使大孔网状聚合物吸附剂溶胀;选用溶剂应容易溶解吸附物。
对弱酸性物质可用碱来解吸 ，弱碱性物质可用酸来解吸
吸附在高浓度盐类溶液中进行时，水洗即可解吸
第七章 凝胶层析
n1、葡聚糖凝胶的孔径大小取决于 交联度 ，其越小，凝胶孔径 越 大 ；而琼脂糖凝胶的孔径却依赖于 琼脂糖浓度 。
n2、琼脂糖凝胶的一个特征是分离的分子量范围非常大，其分离范围随着凝胶浓度上升而 降低 ，颗粒强度随浓度上升而 提高 。
选择：
n1、凝胶层析中，有时溶质的Kd>1，其原因是 （ B ）
qA.凝胶排斥 B.凝胶吸附 C.柱床过长 D.流速过低
n2、凝胶层析中，有时小分子溶质的Kd<1，其原因是（A ）
qA.水合作用 B.凝胶吸附 C.柱床过长 D.流速过低
n3、在凝胶层析中样品各组分最先淋出的是（A ）
qA.分子量最大的 B.体积最大的 C.分子量最小的 D.体积最小的
n4、为了进一步检查凝胶柱的质量，通常用一种大分子的有色物质溶液过柱，常见的检查物质为蓝色葡聚糖，下面不属于它的作用的是（ C ）
qA.观察柱床有无沟流 B.观察色带是否平整
qC.测量流速 D.测量层析柱的外水体积
思考题
1.凝胶层析的原理及特点。
凝胶层析原理：
n 凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析等。
n 是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相，由于各组分流经体积的差异，使不同分子量的组分得以分离的层析方法。
特点：（1）凝胶层析操作简便、设备简单(仅需一根层析柱) 。
（2）分离效果较好，重复性高，样品回收率高,接近100%。
（3）分离条件缓和。
（4）应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激 素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化，脱盐、浓缩以及分析测定类。
（5）分辨率不高，分离操作较慢。
2.柱床体积、内水体积、外水体积、基质体积、洗脱体积 、分配系数、全渗入、全排阻
⑴柱体积(VA) ：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因此柱体积又称“床”体积(VA)。
⑵外水体积（Vo）：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常用V0表示。
⑶内水体积Vi ：因凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，水的总和为内水体积，又称定相体积，常用表示。 不包括基质的体积（Vg）。
VA=V0+Vi+Vg
V柱内空间＝Vo＋Vi
柱床体积VA可以通过加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的体积来测定。
VA = 1/4 pD2h计算
外水体积Vo可以通过测定完全排阻的大分子物质的洗脱体积来测定，一般常用蓝色葡聚糖-2000作为测定外水体积的物质。因为它的分子量大（为200万），在各种型号的凝胶中都被排阻，并且它呈蓝色，易于观察和检测。
⑷峰洗脱体积（淋出体积Ve）：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积，常用Ve表示。Ve=V0+Vi ,ace
Vi ，ace是Vi的一部分，它与Vi之比成为Kd（分配系数）
Ve=V0+Vi Kd
（5）（排阻系数）分配系数Kd
n 当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。
n 当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。
n 0＜Kd＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。
因此分子的正常Kd值0~1之间,这种由小到大的Kd值顺序决定了物质流出的顺序。
3.了解葡聚糖凝胶、生物凝胶、琼脂糖凝胶的结构及特点
⑴葡聚糖凝胶 (Sephadex)
①结构
商品名为Sephadex G类。交联葡聚糖的基本骨架是葡聚糖。再经3-氯-1，2-环氧丙烷为交联剂，形成三维网状结构的高分子化合物。其交联度是通过交联剂的加量及反应条件来控制的。
②性质：稳定性。存在非特异性吸附
⑵聚丙烯酰胺凝胶（生物凝胶）
①结构：商品名为生物凝胶-P（Bio-Gel P）。该凝胶由丙烯酰胺组成；以亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，聚合而成。
②聚丙烯酰胺凝胶的性质：
1）孔径大小（可通过交联度调整）；
2）稳定性、强度；
3）无非特异吸附，保存方便；
4）生物凝胶的编号反映出它的分离界限。如Bio-Gel P-100。
⑶琼脂糖凝胶
①结构：是由β-D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖以α-1，3-和β-1，4-糖苷键相间连接而成的链状分子。
②特点Α、没有共价键的交联。
Β、孔径 琼脂糖的浓度。
C、琼脂糖凝胶的化学稳定性较差。
D、颗粒强度差。
E、非特异性吸附力低。
F、分离范围大。
4.什么是“类分离”和“分级分离 ”？
(1).将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离。
(2).将分子量相差不大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。
5.在实验中应如何选择凝胶与预处理？
（1）凝胶的选择：
一方面要考虑凝胶的性质，包括凝胶的分离分子量范围（渗入限和排阻限），理化稳定性，强度、非特异性吸附性质等；另一方面还要注意到分离目的和样品的性质。
①选择作类分离的凝胶是，应使样品中大分子的分配系数Kd=0，小分子的Kd=1。
②选择作分级分离的凝胶型号时必须使各种物质的Kd值尽可能相差大。要使组分的分子量尽可能分布在凝胶分离范围的两侧，或接近两侧的位置。如果样品中含有3个组分，最好一个接近全排阻，另一个接近全渗入，第三个为部分渗入，且分子量大于渗入限的3倍，并小于排阻限的1/3。
（2）凝胶粒度的选择：
n 细粒凝胶柱流速低，洗脱峰窄，分辨率高，用于精制分离或分析。
n 粗粒凝胶柱流速高，洗脱峰平坦，分辨率低，用于粗制分离，脱盐。
此外，凝胶颗粒必须均匀，颗粒越小更好。
（3）预处理：
n 凝胶在使用前须溶涨，使干胶颗粒充分吸收溶剂，并达到平衡。
n 干胶以10倍以上吸液量的溶剂浸泡。
n 热法溶涨(水浴)。
6.凝胶用过后，有那几种保存方法？
葡聚糖凝胶有3种，干法、湿法和半缩法
湿法：加入一定量的防腐剂置于冰箱中作短期保存（6个月以内）。
常用0.02%叠氮化钠、0.02%三氯叔丁醇、20%乙醇等。
干法：用浓度逐渐升高的乙醇分步处理洗净的凝胶，脱水收缩，抽滤，用60~80℃吹干。
半缩法：60-70%乙醇使凝胶部分脱水收缩，封口，4℃保存
琼脂糖凝胶做成珠状后不再脱水干燥，否则不能再溶胀恢复原有形状，因此商品在都以含水状态供应，并应在湿态保存。一般悬浮在103mol/L EDTA和0.02%叠氮化钠溶液中。避免硼酸缓冲液
7.凝胶层析的操作步骤？
（1）样品和加样
蛋白质类样品浓度:不大于4%。样品粘度小于0.01Pas；样品浑浊应先过滤除颗粒后上柱
（2）洗脱与收集
1）.洗脱剂：常采用缓冲盐溶液进行洗脱；洗脱液的成分也不应改变，以防凝胶涨缩引起柱床体积变化或流速改变。
2） 流速（操作压、型号、粒度）。整个洗脱过程中始终保持一定的操作压；编号小，颗粒粗---流速大；与操作压成正比，柱长成反比。
3） 部分收集器。
（3）凝胶柱的再生
板结、不溶物污染、严重吸附；反冲。重新装柱。
8.细粒凝胶柱流速慢，洗脱峰越窄，分辨率高，适用于什么产品的分离或分析？粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，适用于产品制备那个阶段的分离？
（1）用于精制分离或分析（2）用于粗制分离，脱盐
9.凝胶层析的应用范围有哪几方面？
⑴脱盐和浓缩
⑵分子量测定
⑶凝胶在生化制药中的应用包括：去热原和分离纯化
10.在凝胶层析中要想得到好的层析结果应注意哪些问题和采取那些措施？（答案要补充）
注意有没有色谱峰变宽。措施：减少峰宽效应，选择合适溶剂，填料均匀，填料粒度一致，降低流速，适当增加柱长，增加分辨率里两个峰的峰间距离。
凝胶过滤层析经常遇见的问题:
1)流速慢
（1）有气泡、出水管阻塞
（2）没打开夹子
（3）柱压太紧（操作压过大、长期使用）
2)柱内产生气泡
（1）上水口不流或皮管破裂，洗脱液外流
（2）接口漏气，如上水口螺丝拧的不紧
3)条带扭曲
（1）胶面不平
（2）样品或洗脱液中有颗粒
（3）装柱不均匀
4)分辩率不高
（1）装拄不均匀
（2）样品量过大
（3）流速太快
（4）柱不垂直或柱不合适
（5）长菌
（6）柱下口软管太长
（7）胶不适当
11.根据凝胶层析分离大分子物质的原理，分子质量为2万，6万和10万的蛋白质可选择哪种规格型号的Sephadex G凝胶将三者分开？洗脱后顺序如何？为什么？
选择：Sephadex G-75
洗脱顺序是 10万＞6万＞2万
因为分子量较小的分子可以占据较多的孔体积，而大分子占有的孔体积较小，小分子在柱中停留时间比大分子长，于是样品各组分按分子大小顺序而分开，最先洗脱出来的是最大的分子。
若要脱盐的就选择Sephadex G-25
第八章 离子交换法
1、离子交换剂由 载体 、 功能基团 和 平衡离子 组成。 平衡离子带 正电荷 为阳离子交换树脂，平衡离子带 负电荷 称阴离子交换树脂。
2、写出下列离子交换剂类型：732强酸001x7树脂（强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂 ），
724 弱酸101x4树脂（阳离子型） ，
717强碱201x7树脂（强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂） ，
CM-C羧甲基纤维素（弱酸性阳离子交换纤维素） ,
DEAE-C 二乙基氨基乙基纤维素 （强碱型阴离子交换纤维素），
PBE94 多缓冲交换剂 （碱性阴离子交换剂） 。
3、色谱聚焦（chromatofocusing）是一种高分辨的新型的蛋白质纯化技术。它是根据 蛋白质的等电点 ，结合 离子交换技术的大容量色谱 ，能分离几百毫克蛋白质样品，洗脱峰被聚焦效应浓缩，分辨率很高，操作简单。
4、在采用多缓冲阴离子交换剂作固定相的离子交换聚焦色谱过程中，当柱中某位点之pH值下降到蛋白质组分 等电点（PI） 值以下时，它因带 正 电荷而 下移 ，如果柱中有两种蛋白组分，pI值较 高 者会超过另一组分，移动至柱下部pH较大 的位点进行 聚焦 。
思考题：
1.离子交换层析的原理
利用溶液中带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离。
2.离子交换树脂的分类
分类：平衡离子带正电荷：阳离子交换树脂
平衡离子带负电荷：阴离子交换树脂
具体分为：阳离子交换树脂分类：强酸型树脂、中酸性树脂、弱酸性树脂
阴离子交换树脂分类：强碱型阴离子交换树脂、
弱碱型阴离子交换树脂、
中强碱性阴离子交换树脂
3、离子交换树脂的预处理和再生办法
树脂的预处理
n （1）物理处理：去杂，过筛。
n （2）化学处理：用8～10倍的1mol/L 盐酸或氢氧化钠溶液交替浸泡。
n （3）最后以去离子水或缓冲夜平衡
再生过程：
n （1） 去杂，大量水冲洗，除去物理吸附的杂质。
n （2） 用酸、碱处理除去与功能基团结合的杂质。
n (3) 转型：按要求的人为的赋予平衡离子的过程
4、多糖基离子交换剂主要分为哪两类
q 离子交换纤维素
q 葡聚糖凝胶离子交换剂
5、CM-sephadex C-25（羧甲基纤维素）；C—阳离子
功能基团是：羧甲基；载体是：葡聚糖凝胶；型号是：G-25；类型：弱酸型阳离子交换剂
DEAE-sephadex A-25（二乙胺基乙基纤维素）；A—阴离子
功能基团是：二乙基氨基乙基纤维素；载体是：葡聚糖凝胶；型号：G-25 ；
类型：强碱型阴离子交换剂
7、离子交换法有哪些方面的应用
n 分离纯化——氨基酸制备
n 无盐水制备
8、色谱聚焦的原理
n 自动形成pH梯度。
n 蛋白质的色谱行为
n 聚焦效应
9、K值为离子交换常数， K＞1说明树脂对交换离子吸引力较大
10、由下图，利用给出的两种离子交换剂（E1，E2）分离3种蛋白质（P1、P2、P3），用箭头流程图表示(并指出E1，E2的类型)。
E1弱酸型阳离子交换剂 E2为强碱阴离子交换剂
11、请以CM-C为例说明离子交换纤维素分离纯化蛋白质时的洗脱方法有哪些？并说出各种方法的洗脱原理。
升高环境的pH、降低pH或是增加离子强度都能将被吸附物质洗脱下来。
H2N-P表示蛋白质 C表示离子纤维素
第九章 亲和纯化技术
n1、亲和层析洗脱方法有 非专一性洗脱 ， 特殊洗脱 ，专一性洗脱。
n2、亲和力大小除由亲和对本身的解离常数（亲和势KL ） 决定外，还受许多因素的影响，其中包括 亲和吸附剂的微环境 、载体空间位阻、配基结构以及配基和配体的浓度 、载体孔径 等。
n3、亲和层析中常用作分离酶的配基有 抑制剂 ， 辅因子 ， 底物的类似物 。
n4、亲和层析中非专一性吸附有 离子效应 、疏水基团 、 复合亲和力 。
n5、亲和过滤指的是将 亲和层析 和 膜过滤 结合运用，它包括 亲和错流过滤 和 亲和膜分离 两大方法。
选择题：
n1、制备亲和柱时，应首先选用的配基是 （ ）
nA.大分子的 B.小分子的 C.中等大小的 D.不确定
n2、亲和层析的洗脱过程中，在流动相中加入配基的洗脱方法称作 （ ）
nA. 阴性洗脱 B. 剧烈洗脱 C. 竞争洗脱 D. 非竞争洗脱
n3、亲和层析的洗脱过程中，在流动相中减去配基的洗脱方法称作 （ ）
nA. 阴性洗脱 B. 剧烈洗脱 C. 正洗脱 D. 负洗脱
三、名词解释
1、亲和反胶团萃取
指在反胶团相中除通常的表面活性剂以外，添加另一种亲水头部为亲和配基的助表面活性剂；通过亲和配基与目标分子的亲和结合作用，促进目标产物在反胶团相的分配。
2、亲和膜：
亲和膜利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和层析的变型。
3、二次作用亲和沉淀
亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场使介质与目标分子共同沉淀的方法称为二次作用亲和沉淀。
4、亲和萃取：
利用偶联亲和配基的PEG为成相聚合物进行的双水相萃取，在亲和配基的亲和结合作用下促进目标产物在PEG相（上相）的分配，提高目标产物的分配系数和选择性。
5、亲和吸附剂：
被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。
6、负洗脱： S（固定化配基），E（酶），I（游离配基）
也叫反竞争性效应：ESI>EI稳定性，I使ES结合紧，I ，E洗脱出来。
7、亲和层析：利用生物大分子物质具有与某些相应的分子专一性可逆结合的特性而建立的层析技术。
8、亲和膜分离：是一项新兴的技术，兼有膜分离和亲和色谱的优点，可以有效地进行生物产品的分离和纯化。（用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质的方法。）
9、金属离子亲和层析：利用金属离子的络合或形成螯合物的能力吸附蛋白质的分离系统。
四、回答问题：
1、亲和层析的原理是什么？主要特点是什么？
原理:（1）配基固定化：配基与载体偶联，结合成具有特异亲和性的分离介质。
（2）吸附样品：亲和层析介质选择性吸附生物活性物质.
（3）样品解吸：选择适宜的条件使被吸附物活性物质解吸。
特点：经过一次处理可得到高纯度活性物质 ；
设备要求不高、操作简便、特异性强、分离速度快、分离效果好、分离条件温和；
亲和吸附剂通用性较差，专用的吸附剂。
2、对亲和层析的公式 进行说明。设KL=10-7，求[L0]
（1）对亲和层析公式的说明如下：
式中，E——被分离的酶， L——配基， EL——复合物， KL——为EL复合物的解离常数
根据化学反应平衡方程式：
式中，Eo和Lo——分别为原始的酶浓度和配基浓度，当Lo＞＞Eo时，Lo-[EL] ≈Lo，则
在亲和层析中，定义分配比k为：
一般柱层析公式为：
式中，Ve——蛋白质洗脱体积；Vo——凝胶载体外水体积。由此可导出亲和势与洗脱体积的关系式：
（2）求[L0]：
因为KL=10-7，所以≥10，→[L0]
3、何谓“手臂”？其长短与亲和层析效果有何联系？为什么？
“手臂”就是用来消除空间障碍插在载体和配基间的基团。
手臂的长度是有限的，不可太短也不可太短也不可太长，太短不能起消除空间障碍的作用，太长往往会使非特异性吸附增加。
4、什么是拟生物亲和层析？其中多肽配基有何优点？
（1）拟生物亲和层析是利用部分分子相互作用，模拟生物分子结构或某些特定部位，以人工合成的配基为固定相吸附分离目的蛋白质的亲和层析。
（2）多肽配基的优点：只含有一些氨基酸，即使脱落也不会产生免疫反应；与抗体配基相比，稳定性好；成本低；与金属和染料配基相比，特异性较高，且通常无毒；可采用温和的洗脱条件避免了蛋白质的变性失活，收率高
第十章 离心分离技术
n离心技术：利用旋转产生的离心力代替重力，加速固体沉降速度的一种分离方式 。
n差分离心法：差分离心法亦称为“差速离心法”，是依据不同大小和密度的颗粒在离心力场中沉降速度的不同进行离心分离的一项技术。
n速度区带离心法：又称速率区带离心法或分级区带离心法。它是将样品放在一个连续的密度梯度液体上，通过离心，大颗粒沉降快，小颗粒沉降慢。经过一段时间，相同的颗粒就在同一深度。形成一条带子，因此把各种组份分开来。
n等密度区带离心法：离心力作用下，不同密度的多组分颗粒在梯度介质中“向上”或“向下”移动，当移动至其密度与介质密度相等的位置便不再移动，形成静止区带，即达到离心平衡，各组分按密度不同处于区带的不同位置。该离心方法称等密度离心法。
第十一章 膜分离技术
1、克服浓差极化现象的措施有 振动、 搅拌 、 错流 、 切流 。
1、透析是膜分离技术的一种，通常利用透析技术进行 ( B )
A 脱脂 B 脱盐 C 除菌 D 除热源
2 在超滤过程中，主要的推动力是（ C）
A. 浓度差 B. 电势差 C. 压力 D. 重力
问题:
1.不对称膜、超滤、浓差极化现象
（1）不对称膜指膜的化学结构或物理结构随膜的部位而异，即各向异性的膜。
（2）超过滤(简称超滤)是一项分子级膜分离手段，以压力差为推动力将不同分子量的物质进行选择性分离。一般用于液相分离，也可用于气相分离。
（3）外源压力迫使分子量较小的溶质通过薄膜，大分子被截留于膜表面，并逐渐形成浓度梯度，这就是浓差极化现象。
2.简述膜分离的优点
①高效：由于膜具有选择性，它能有选择性地透过某些物质，而阻挡另一些物质的透过。选择合适的膜，可以有效地进行物质的分离，提纯和浓缩。
②节能：多数膜分离过程在常温下操作，被分离物质不发生相变, 是一种低能耗，低成本的单元操作。
③过程简单、容易操作和控制。
④不污染环境。
3.用于制作透析膜的材料所应具有的特点
（1）在溶剂中能形成分子筛状多孔薄膜，只允许小分子溶质通过，而阻止大分子（如蛋白质）通过；
（2）化学惰性；在水、盐溶液、稀酸或稀碱溶液中稳定；
（3）良好的物理性能：有一定的机械强度和良好的再生性能
4.透析过程中应注意哪些事项？
（1）透析袋预处理：用50%乙醇慢慢煮沸一小时，再分别用50%乙醇、0.01mol/L碳酸氢纳溶液、0.001 mol/L EDTA 溶液依次洗涤，最后用蒸馏水洗涤三次；
（2）透析前，对装有试液的透析袋检查是否有泄漏；
（3）透析袋装一半左右，防止膜外溶剂因浓度差渗入将袋涨裂或过度膨胀使膜孔径改变；
（4）袋要扎紧以防流失。
（5）热敏性物质应置4℃冰箱透析以防变性。
（6）搅拌；定期或连续更换外部溶剂可提高透析效果。
（7）透析袋的保存：短时间，储存于4℃蒸馏水中，长时间，洗净后置于甘油中（防菌）
5.影响超滤流速和选择性的因素有哪些？
n 溶质分子性质：大小、形状和带电性质。
n 超滤膜的性质：孔径、结构、吸附性。
n 超滤装置和操作：膜或组合膜的构造、超滤器的结构以及操作压力、搅拌情况.
n 液体物料的温度、粘度、pH、离子强度。
作业题
总结归纳本课程介绍的可用于物质分离纯化的方法，并说出每种方法的原理。
固液分离技术
q过滤、离心
萃取
q 溶剂萃取、双水相萃取、反胶团萃取、超临界萃取
固相析出分离法
q 盐析法、有机溶剂沉淀法、结晶法、等电点沉淀法
层析技术
q 吸附层析、凝胶层析、离子交换层析、离子交换色谱聚焦、亲和层析
膜过滤
q 透析、超滤、微滤
作业题
比较吸附层析、凝胶层析、离子交换层析、离子交换色谱聚焦、亲和层析五种层析技术并填写下表
