分子生物学技术在食品工业中的最新研究进展
0引言
了解食品中的微生物群落组成以及不同微生物种群之间的相互作用，对于生产出安全和高品质的食品是非常重要的。食品生产过程中相关微生物的研究通常采用培养的方法，但这种方法存在很大的局限性：①富集培养大多具有选择作用，导致不能分离出具有重要生态学作用、数量相对较少的种群，不能定量研究微生物种群的动态变化；②受到食品环境胁迫或受损的微生物细胞，通常需要特殊的培养条件才能恢复生长，导致其难以被分离。大量的研究表明，传统的微生物学培养分析方法，获得的可培养微生物种群只占微生物总量的0.1%-5%。尽管对于微生物群落结构相对简单的食品来说（如发酵食品），可培养的微生物一般占有优势，但Ampeul认为，至少有25%～50%的微生物种群不能被培养。这种缺陷促进了以聚合酶链反应(PGR)技术为基础的分子免培养方法和核酸检测技术在食品微生物研究中的应用和发展。与常规培养方法相比，分子生物学技术具有快捷、灵敏、准确等优点，而且具有更高的特异性，能够更加精确地研究生态系统中的微生物多样性及其群落组成。
微生物学家已经认识到研究微生物生态学概念和理论，对于了解食品中微生物的繁殖与生长非常重要。譬如研究微生物群落组成能够更好地了解奶酪、酸奶、香肠、葡萄酒、面包等食品的风味组成以及微生物对其储藏品质的影响；密切监测食品生产过程中微生物群落的动态变化，能够更好地了解和控制食品加工和后熟过程中的微生物作用；可以快速、准确地监测食品中可能存在病原微生物，以加强食品生产过程中的安全性等。因此，在种、菌株水平上，对食品环境中微生
物的准确监测和可靠鉴定以及微生物群落组成、动态变化的生态学研究，有助于保证食品的质量安全。与土壤、水环境等生态系统的研究相比，到目前为止，用于食品加工过程中微生物研究的分子生态学的方法还相对较少，目前使用最多的是变性梯度凝胶电泳技术。尽管如此，这些方法在食品工业中（尤其在发酵食品中）正逐渐被使用。 中国的传统发酵食品行业历史悠久，品种多样，如食醋、酱油、白酒、黄酒、豆豉、腐乳、酸菜、乳酪以及发酵肉制品等。传统发酵食品工艺多为天然发酵，其微生物群落结构比较复杂，产品风味具有明显的地域性。传统的发酵行业对酿造工艺过程中的微生物群落动态变化、风味及功能性物质的形成和累积机制的研究明显滞后，对传统发酵工艺的机制缺乏深入了解。以天然的复杂菌种混合发酵工艺为主的绝大多数企业，其生产质量控制主要靠工程技术人员长期工作积累的经验来判断，难以对发酵产品品质进行稳定的控制。分子生态学技术能够对发酵过程进行定量监控，通过检测发酵过程中微生物群落的组成结构、种群动态变化情况，有助于从整体上进行全面的分析，深入认识微生物的发酵机制，并为监控和调整发酵过程奠定基础。
1 目标基因的选择
自20世纪80年代中期以来，PCR技术已成为科学家们用来研究微生物群落结构及多样性的最主要工具。一般而言，以DNA为模板，利用通用引物通过PCR反应扩增目标基因，产生的基因序列大小相同，因此需要依据基因序列的差异来区分不同的微生物。所以，分子生态学研究的关键步骤就是选择合适的目标基因。合适的目标基因既要有保守区段，又要有可变区段。可变区段可以在不同的分类水平上区别微生物，保守区段位于可变区段两侧，用来作为引物复性结合的位点进行PCR。如果没有高度保守区域，较低保守程度的区段也可作为简单引物退火
结合的位点。通常在分子生态学研究中，主要采用能够反映微生物系统发育关系的、在微生物基因组中普遍存在的基因作为PCR扩增的首选目标。此外，编码蛋白的功能基因也可被用来研究微生物类群的功能多样性。 目前，由于细菌rRNA操纵子（包括16S rRNA基因、23S rRNA基因以及基因间隔序列，IGS）在所有的微生物类群的基因组中都存在，而且符合以上微生物分子生态学研究作为分子标记的条件，是目前微生物生态学研究中最常用的分子标记。尤其在RDP等基因序列数据库中，已经积累了几千万的基因序列，能够很方便地通过比较来描述某一群落中存在的微生物种群。目前发现，rRNA基因序列有时并不具有足够的序列差异来区别亲缘关系很近的、占据不同生态位的分类单位。
Palys等人在研究相近群落中一些细菌的生态多样性时，证明蛋白质编码基因序列比16S rRNA基因更为有效。此外，由于大多数细菌基因组中rRNA基因存在多个拷贝，其序列的差异使得分子生态学结果的解释和分析复杂化。因此，单拷贝的、不同分类单位之间显示较大序列差异的持家基因越来越受到更多的关注，这些基因包括促旋酶基因(gyrB)、延长因子基因(tuf）、热激蛋白基因(dnaK)、RNA聚合酶基因(rpoB)以及reeA基因等。然而，与16S rRNA基因相比，这些基因在数据库中目前只有少量的序列，这使得它们在微生物生态学中的应用受到很大的限制。
对于特定环境中某个具体的微生物生态学过程，可以通过分析生态学过程中发挥关键作用的功能酶基因的多样性以及确定优势基因的多态性来监测生态系统的功能多样性。对于土壤和水环境而言，功能多样性分析过程主要包括氮素循环、硫酸盐还原、氨氧化以及多环芳烃化合物的降解等。就目前来看，虽然已有一些利用功能基因来分析检测和鉴别食源性人类病原体的报道，但迄今为止，还
没有在食品工业中利用功能基因多样性进行食品微生物生态学作用研究的报道。这方面有待深入研究。
2食品微生物群落分析技术
研究微生物群落一般采用3个基本指标，即多样性、相似度和丰度。目前用于微生物群落分析的大多数分子技术并不全面，只能从一个侧面帮助了解微生物群落。基于PCR技术研究微生物群落的方法有：①利用通用引物扩增产生混合PCR产物，再通过其他技术进一步分析；②通过特异性的PCR反应检测和定量特殊功能类群的微生物或目标基因。
分子生物学技术在食品工业中的最新应用研究见表1。
2.1食品微生物多样性研究方法
2.1.1 变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)
变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)，通过PCR扩增相同长度的的DNA片段(200-700 bp)，其PCR正向引物的5 7末端带上一个35～40 bp的GC发卡结构，以保证扩增的DNA片段在变性凝胶中至少能保持部分的双链结构。依据DNA序列差异具有不同的变性浓度或者温度，在变性剂梯度或者温度梯度的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，检测微生物多样性。理论上，可以检测和区分只有1个或几个碱基对差异的核核酸片段。
19xx年DGGE技术首次应用于食品微生物学，Ampe[1研究了墨西哥玉米发酵面团中的微生物空间分布。此后，DGGE技术被广泛应用于分析食品及其相关产品的微生物群落组成差异及监测微生物种群数量动态变化，包括矿泉水、葡萄酒、香肠、乳制品、发酵木薯面粉、牛肉、鱼等。16S rRNA基因V3区段由于长度与序列的种属差异使得该区段在食品微生物DGGE/TGGE技术中作为首选的目标序
列。最近，一些DGGE技术以mRNA进行PCR来研究生理代谢活跃的种群多样性。DGGE技术和TGGE技术的主要优点是在许多分子实验室都可以进行，而且结果的解释相对简单。但是，由于PCR产物片段很短，序列所含信息较少，使得微生物的分类鉴定准确度降低；而且，不同的序列可能有相同的电泳迁移率，导致了不同片段的共迁移。DGGE/TGGE技术的最主要缺点是缺乏可重复性，另一个缺点是普通凝胶的染色方法使得其灵敏度较低，导致一些代表稀有种群的带丢失，使用荧光标记的引物可提高检测的灵敏度。
2.1.2单链构象多态性(SSCP)
另一种依赖于PCR产物电泳分离，并已用于微生物群落分析的技术是单链构象多态性(SSCP)。与DGGE/TGGE技术不同，SSCP技术以单链折叠产物的构象差异为基础分离PCR产物。变性后，单链DNA片段在非变性条件下，由于核苷酸序列不同，形成的二级结构不同，分子量相近的产物被分离。一般情况下，SSCP与DGGE/TGGE技术具有相同的优缺点。由于引物不需要带发卡结构，PCR扩增结果比DGGE或TGGE更有效。SSCP技术主要的缺点是由一个单链DNA片段可能会形成几个稳定的构象，导致凝胶中出现多个带。此外，在分析多样性较高的复杂微生物群落时，需要上载较高浓度DNA样品，DNA单链在电泳时重新复性的概率很高。SSCP已被用于研究不同环境中的微生物群落，但在食品工业的应用中，目前仅限于干酪微生物的研究。
2.1.3末端限制性内切酶片段长度多态性
T-RFLP是另一种以PCR技术为基础的群落带谱分析法，通常用于比较分析微生物群落。目标基因首先被荧光标记的引物扩增（只有1个引物被标记），然后酶切，最后在自动测序仪上分离和检测。在电泳峰图中，只有被标记的末端限
制性内切酶片段能被检测出，其长度的不均匀性表明群落的复杂性。选择的限制酶越多，T-RFLP的检测灵敏性越高，能够检测单个碱基差异的核酸片段，而且能够很好的同时检测大量的样品，譬如确定多个样品微生物群落结构的时空变化。这种方法在精确预测微生物群落结构有一定局限性，由于不完全或非特异的限制性酶切，产生假的限制性片段，导致微生物多样性的过高估计。另一个限制因素是软件预测和实验获得的限制性片段实际长度之间的差异。此外，一个不确定因素是由于荧光染料的选择引起的，要仔细的评估引物和标记染料，优化实验方法。尽管存在缺陷，T-RFLP还是一种非常有效的微生物群落分析的分子技术，尤其需要高通量和高灵敏度分析时，不需要直接的序列信息。T-RFLP技术的有效性在微生物生态学中不同研究领域已经得到广泛的体现，在食品工业中，T-RFLP技术也被越来越多的成功应用于微生物群落分析，譬如水产业、酸奶和奶酪生产以及制糖工业。
2.1.4扩增核糖体DNA限制性分析
扩增核糖体DNA限制性酶切分析(ARDRA)，也被称为16S rRNA基因的限制性片段长度多态性(RFLP)，是一个相对简单的PCR技术为基础的指纹图谱技术，先酶切PCR扩增的群落rDNA，然后通过凝胶电泳分离。这种技术能够被用于微生物鉴定，也可以比较微生物群落和动态变化。与T-RFLP技术不同，检测到所有的酶切片段，虽然提高了分辨水平，但增加了图谱的复杂性，不能有效的比较和解释图谱。由于单个限制性内切酶不具有高的分辨力，多个限制性内切酶单独或者组合使用有可能获得较好的结果。该技术另外一个缺点是由于凝胶中染色剂的检测灵敏度有限，导致微生物群落中丰度较低种群不能检出和系统发育信息的丢
失。因此，只有在分析组成相对简单的群落时，该技术才被首选。目前，还没有发现该方法用来研究食物中微生物多样性的报道。
2.1.5核糖体间隔区分析
微生物核糖体基因间隔区(IGS)在长度和核苷酸序列上比16S rRNA和23S rRNA基因具有更大的差异（长度一般在400-1 200碱基），因此在菌株水平上被广泛用来对微生物进行分型研究。自动核糖体间隔序列分析技术(ARISA)就是用荧光标记的通用引物PCR扩增群落总DNA中各种细菌的16S rRNA和23S rRNA基因之间的序列，随后在自动化系统上进行凝胶电泳分离，激发光检测代表不同种类微生物的大小不一的DNA扩增片度。ARISA技术检测微生物存在的问题是PCR可能优先扩增短的模板。此外，由于在同一种微生物基因组中存在多个核糖体基因操纵子，其中IGS序列长度差异的存在，可能使一种微生物产生多个检测信号而产生偏差。为了提高实验重复性和标准化操作，Cardinale评价了不同引物组合的适用性、灵敏度、重复性，以及环境微生物群落ARISA分析最适的引物的选择。同DGGE/TGGE、T-RFLP技术一样，ARISA技术已经成为研究微生物生态学的常用方法。虽然在食品微生物分离菌株的分子分型研究中，间隔序列分析技术(RISA)被经常使用，到目前为止，被用于食品微生物群落分析的研究报告仅有1例，即用于山羊奶微生物分析。
2.2食品微生物类群鉴定
目前，对于许多食品及其加工工艺中存在的微生物研究，不仅要了解其中微生物多样性以及不同样本之间的群落差异，还要了解发挥最关键作用的微生物类群。例如了解生产中不利于食品加工的微生物、产生干酪独特风味和口感的关键微生物类群等。
2.2.1 克隆文库法
要获知群落中微生物的组成，可以采取割胶纯化泳带、克隆测序法，也可以通过PCR扩增产物直接克隆和测序，确定群落的微生物物种组成。目前许多研究通过16S RNA基因克隆文库构建、序列比对、数据库搜索来研究食品基质中微生物。
目前，由于高通量测序技术的长足进展，数据库中大量序列信息的累积储存，使得克隆文库法更容易应用，但该技术比较繁琐、费时，尤其在处理多个样品时，有时需要测序几千个克隆子，以便尽可能多覆盖群落中隐藏的微生物信息。虽然可以采取酶切鉴别克隆子的方法减少克隆测序的工作量，但可能丢失基因序列代表的食品微生物信息。因此，克隆文库法可以与指纹技术（包括DGGE，T-RFLP，SSCP等）联合使用，用以研究较为复杂的食品基质中的微生物群落，以便确定大致所需要测序的克隆子数量。目前，最有希望推广的测序技术是费用相对低廉的、高通量的焦磷酸测序技术，最大的优势是不需要克隆，可以避免异常重组的产生和人为因素造成的克隆偏差。该技术已应用于环境微生物研究，目前还没有应用该技术研究食品微生物群落的报道。
2.2.2 DNA微阵列技术
DNA微阵列技术最初用于研究基因表达或单核苷酸多态性分析，尤其适合一个样品中许多未知DNA序列鉴定。此项技术基于特异的寡核苷酸探针被固定在固相载体上与被检测的同源标记的目标扩增子杂交，已被证明是环境中微生物鉴定的最成功的方法，即使检测样品中种群之间只有1个单核苷酸差异。DNA微阵列技术克服了许多指纹图谱分辨率低、需要样品大以及克隆测序成本高的弱点，而且，由于杂交信号与靶DNA数量成正比，该技术还能进行定量研究。基于检测的
靶基因，DNA阵列一般可分为3类：①以16S rRNA基因为靶基因的系统发育类群微阵列，主要用于微生物多样性研究；②功能基因阵列，用于检测特定环境中的关键功能基因；③宏基因组微阵列，直接固定环境中提取的DNA片段，检测未知基因序列。在食品中，DNA阵列技术被成功用于直接检测气调包装蔬菜沙拉中的微生物群落以及高糖果汁贮存过程中的微生物种群。此外，DNA阵列技术已被广泛用于包括食品在内的各种环境中病原微生物的检测。DNA阵列技术最大的优势就是可以通过开发寡核苷酸探针无限的扩大检测能力和检测范围，但存在的缺陷是无法检测还没有特异寡核苷酸探针的微生物类群。
2.2.3 荧光原位杂交技术(FISH)
荧光原位杂交技术是综合了显微镜观察的简捷性和DNA杂交的特异性的一种分子技术，一般是利用荧光标记的DNA探针与特殊类群微生物的核糖体基因的某个特异区段杂交，然后通过荧光显微镜或者流式细胞仪直接检测样品中微生物的丰度。该技术通过对原位样品尽可能小的扰动，广泛应用于环境微生物研究。在食品微生物研究中，被用来检测酒中的乳酸菌、奶酪亚表面存在微生物以及发酵食品中的益生双歧杆菌等。目前，荧光原位杂交技术最新的研究进展是用分子信标取代线性的寡核苷酸探针，具有更好的区分能力。此外，利用分子信标技术减少了洗涤的步骤，从而减少了细胞的凝集成团和损失，有助于更精确的计数。理论上，荧光原位杂交技术可以检测样品中的单个细胞，然而在实践中，检测水平大约是1 000个细胞/mL。因此，相对于PCR为基础的检测技术，荧光素原位杂交技术的检测灵敏度较低。另一个局限性是高通量样本检测时，自动化程度不高。要深入了解微生物群落，就要在更高分辨水平上设计许多的探针，因此探针的设计对于FISH技术的有效应用是一个瓶颈。
2.3食品微生物定量研究
对微生物研究来说，除了了解一个群落的组成及其中占优势的种群之外，在更多情况下还要了解某个种群的数量大小（丰度），而PCR扩增的非线性使得确定原始样品中DNA量与最终获得序列的量之间的相关性分析成了问题。因此，基于PCR的指纹图谱技术（如DGGE，T-RFLP技术）以及DNA阵列技术都可以看作是半定量的。目前，通过实时定量PCR技术(Real-time PCR)可以实现样品DNA的精确定量。与常规PCR技术相比，Real-time PCR基于荧光信号的释放连续监测DNA的扩增过程，而无需反应后处理。样品DNA的初始浓度与1个阈值相关（即荧光信号增强到背景之上的循环数）。在食品微生物学研究中，实时PCR也亦被用于检测和定量特殊类群的微生物。然而，由于不同荧光染料数量有限以及定量PCR仪激发光源的限制，在同一个反应管中的PCR反应目前只能检测少数几个靶目标，这限制了Real-time PCR在复杂食品基质中微生物群落的定量分析。因此，Real-time PCR技术目前需要解决的问题就是尽可能发展多通道定量分析技术，能够同时定量检测特定样品中的多种微生物。
3展望
在过去20年间，随着PCR及其相关技术的发展，微生物生态学研究呈现飞速发展的态势。目前，首先需要解决的问题是如何正确合理地分析所获得的数据信息与各种环境因素的相关性。由于应用分子生态学研究起步较晚，因此，选择何种技术来研究微生物群落取决于研究目标、研究成本、样品数量、群落复杂性、实验人员专业性以及需要满足的分辨力和灵敏度等。一般而言，T-RFLP，TGGE／DGGE．SSCP指纹技术能够让我们对微生物群落有一个大致了解，为深入分析提供相关的数据；结合克隆文库分析技术，可以对微生物群落进行全面了解；通
过DNA阵列和Real-time PCR技术定量检测食品基质中的优势微生物、关键微生物类群。由于Real-time PCR技术可以定量检测环境中某个特殊的微生物，可以用来分析检测食品中的病原微生物，促进HACCP和安全控制的实施，从而保证食品质量安全。此外，分子生物学分析技术与传统微生物研究方法是相互促进、共同发展的，随着对微生物多样性的了解，以及大量与微生物遗传和代谢相关基因数据库信息的扩展，相信可以解决大量微生物难以培养的瓶颈问题。能够更加全面地了解微生物，更好地为人类造福。