首过效应：药物经肠道吸收首次进入肝脏时，有些药物可被肠液或肠道上的肠菌酶破坏，或在肝内受到微粒体混合功能氧化酶代谢，使进入体循环的药量减少。
肠肝循环：药物经胃肠吸收，经胆汁分泌进入小肠或药物经吸收后在肝转化为代谢物，经胆汁分泌排入小肠，在小肠处重吸收的过程。特征为“双吸收峰”。
平衡透析法：将含药物的血浆与透析液放置于半透膜两侧，在一定温度下搅拌使其平衡。半透膜能阻挡血浆蛋白和结合药物的血浆蛋白，而游离药物自由通过半透膜并达平衡。优点：平衡状态下，结果真实可靠 缺点：受稀释作用影响，费时
超滤法：利用离心力迫使药物通过半透膜，同时血浆中水分也不断被滤除，使样品管内血浆样品不断浓缩，打破了药物与血浆蛋白结合的动态平衡。优点：设备简单，时间短，收集到足够的超滤液可直接进样 缺点：非平衡状态下测定。
液液萃取法：基于被测组分在不混溶的两种溶剂中的分配系数不同而得到分离。
固相萃取：SPE是一种吸附剂萃取，样品通过填充吸附剂的一次性萃取柱，分析物和杂质被保留在柱上，然后分别用选择性溶剂去除杂质，洗脱出分析物，从而达到分离的目的。
萃取方法选择：1较亲脂药物最好用烷基硅胶键合相省时，碱性药物用大孔树脂为佳。 2较亲水且具有酸碱性，可电离，采用离子交换树脂；3较亲水但不能解离，不易萃取，沉淀蛋白后直接进样
柱切换技术：指由阀来改变流动相走向与流动相系统,从而使洗脱液在一特定时间内从预处理柱进入分析柱的技术。
衍生化技术：在色谱过程中用特殊的化学试剂，借助化学反应给样品化合物接上某个特殊基因，使其转变为相应衍生物之后进行检测的方法。目的：1使极性药物变成非极性易挥发药物，使其具有能被分离的性质。2增加药物的稳定性。3提高对光学异构体的分离能力。
顶空气相色谱法：在封闭恒温系统中气相和凝聚相（液相或固相）存在着分配平衡，因此气相的组成能反应凝聚相的组成，用GC法来分析平衡体系中气体的方法。分为静态顶空气相色谱法和动态顶空气相色谱法。
微透析技术：实质是一种膜分离技术，利用膜透析原理，微量地对细胞液进行流动性连续采样的采样和色谱样品制备技术。
电渗流：在pH>3时，毛细管壁上的硅羟基负离子使毛细管壁内表面带负电，和溶液接触时相应的缓冲液带正电，形成双电层。在高电压作用下，双电层中水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动，该现象叫电渗流。具平面流型。
毛细管电泳免疫分析法(CEIA)：利用抗原抗体复合物与游离的抗原抗体在电泳行为上的差异，将毛细管电泳作为分离分析的手段，分为竞争性CEIA和非竞争性CEIA。
P450酶的生物学特性：1.P450酶是一个多功能的酶系.2.P450酶对底物的结构特异性3.P450酶存在有明显的种属、性别和年龄的差异.4.P450酶具有多型性和多态性.5.P450酶具有可诱导和可抑制性.
肝微粒体体外温孵法：用制备的肝微粒体辅以氧化还原辅酶（NADPH再生系统），在模拟生理条件下进行代谢反应，经一段反应时间后，采用HPLC、LC-MS和LC-MS/MS等方法对待测物进行初步分析和鉴定。
一、选择哪一种离子源？
1.电喷雾离子化（ESI）原理：通过电场使雾滴带电，然后通过离子蒸发等机制生成气相离子，再送入MS的过程。将离子由液相转至气相为强吸热过程，能量大于C-C键断裂能。但ESI可在相对低温下，逐步去溶剂化，是最软的质谱离子化方式。三个步骤：静电喷雾；去溶剂；离子蒸发。
2.大气压化学离子化（APCI原理：大气压条件下采用电晕放电使流动相离子化，然后流动相作为气相试剂使样品离子化的技术。离子化可通过质子化或电荷转移，去质子, 电子捕获及形成加合物等方式实现。
3.大气压光离子化（APPI）
ESI：通过喷口与毛细管间高压离子化，适于中、强极性化合物，特别是在溶液中能预先形成离子化合物和可以获得多个质子的大分子，对流动相组成有要求。
APCI：通过电晕针放电离子化，流动相作为化学离子化反应气，适于非极性、中等极性小分子。不适于热不稳定、难于气化的极性和大分子化合物。离子化过程对流动相组成依赖小。
APPI: 通过吸收光子而离子化，适用于有共轭基团的非极性或弱极性物质。介质效应小，对磷酸盐有很好的耐受，较ESI有较小的离子抑制。
二、待测物什么情况下需要采用衍生化, 如何选择合适的衍生化试剂？
优点：1增强离子化效率；2改变分子碎裂类型；3改善分离效果；4优化色谱行为 。
1. 小分子非极性化合物：小分子醛、酮类化合物. 对于这类化合物较难质子化。使用最多的衍生化试剂是硝基苯肼类化合物，通过引入易质子化的含氮基团和能促进雾化的疏水芳香基团来提高离子化效率。
2.小分子极性化合物：极性基团虽够有效促进待测物解离, 但是疏水结构特征对于一个待测物在离子源中的有效雾化也极其重要，并且可以使待测物在常用的反相色谱柱上得到适当保留，因此,往往需要通过衍生化的方法引入一些疏水基团以提高待测成分的离子化效率并且增加色谱保留。
a.氨基酸类:同时具有易质子化的基团(氨基)和易去质子化的基团(羧基), 在离子化过程中易发生反荷离子效应进而导致该类化合物的质谱响应极弱, 甚至没有质谱响应。
对策：通过简单的衍生化反应掩蔽羧基或氨基
b.羧酸类：一些结构较小并且极性较大的羧酸，质谱响应和色谱保留行为均不理想。
对策：使用衍生化掩蔽羧基同时引入一些离子化能力较强的基团.
c.嘌呤嘧啶拮抗物：极性很强, 且缺乏合适的离子化官能团。
常用衍生化试剂：丹酰氯 重氮甲烷 对溴苯甲酰甲基溴 （具体例子见笔记 ）
3.痕量待测物：如激素类药物的检测, 衍生化也可以作为一种提高灵敏度的重要手段。
4. 蛋白质以及多肽： 5. 不稳定化合物：如易氧化化合物
五、如何正确地认识并且科学地评价残留效应？
残留效应(carry-over effect，COE) ：指在高浓度的样品进样分析后, 在进样系统中残留了一定量的待测物, 从而影响了下一次进样时低浓度样品测定结果的准确度。
产生原因：清洗自动进样针的溶剂选择不当、洗针和进样程序设计不合理或者是进样针座吸附了待测物.
对策：1.采用甲醇-水(50:50)组成的洗针液能有效清除进样针上的残留待测物。但对疏水性极强的化合物, 采用更高比例的甲醇能更有效地消除残留效应。2. 在自动进样器中产生残留的主要部位是进样阀,通过改变进样模式消除。 评价方法：观察连续分析高浓度样品后空白溶剂或空白样品的待测物位处有无信号。若无响应信号，则判为无残留效应。若有信号且大于10%LLOQ的响应，则判断为有残留效应干扰，需改进方法；若小于10%LLOQ的响应，则判断为残留效应可忽略。
六、如何正确处理高通量分析和专属性之间的关系？
高通量 LC-MS 分析有时会导致假阳性结果, 进而降低测定结果的可靠性。
原因1：二相代谢物容易在离子源内发生中性丢失反应形成与母体药物相同的离子, 从而影响对后者的准确定量。对策：调节色谱保留使其在LC中分开后再进入MS。
原因2：质谱的专属性有时还受到其自身分辨力的限制, 尤其单个离子或是伪离子对检测时。对策：在选择检测离子/离子对时, 不仅要考虑检测对象在质谱中的绝对响应, 还应注意选择受生物基质干扰较少的监测离子或离子对,如一些小分子的中性丢失反应(如脱水反应)就不适合作为监测对象
二、何为LC-MS的介质效应？建立生物样品中药物的LC-MS测定方法时如何进行介质效应的考察？其评判标准是什么？
介质效应（ME）是指样品基质中其他成分对待测物响应值的影响。
对策：a优化改进样品提取制备方法；b优化色谱条件；调节色谱保留；改善峰形；梯度洗脱；加入添加剂c减少进样体积；d根据被测药物离子化机理选择合适的质谱接口，并优化质谱分析条件；抗基质干扰能力依次为: APPI＞APCI＞ESI；e选择合适的内标
考察：标准曲线法：本法需配制2组不同的标准曲线，每组包括5条标准曲线。第1组用流动相配制，制成含系列浓度待测组分的标准曲线。第2组标准曲线是将5种不同来源的空白生物样品(如：血浆)经提取后分别加入与第1组相同系列浓度的待测组分后制得。通过比较两组标准曲线的斜率，可以确定基质效应对定量的影响。分别求得第1组和第2组标准曲线斜率的平均值：S1和S2。
ME＝│S1－S2│/S1×100％ 若ME≤15％，则表示无介质效应或介质效应可以忽略。
ME＝S2/ S1×100%，若85%≤ME≤115％，则表示无介质效应或可以忽略。
三、分析方法验证内容与要求
⑴特异性：考察来自6个不同个体的空白生物基质，必须证明所测定物质是受试药品的原形药物或特定活性代谢物，生物样品所含内源性物质或其他代谢物及替他药物不得干扰对样品的测定。
⑵标准曲线和定量范围：配制标准样品应使用与待测样品相同生物介质，至少用6 个浓度建立标准曲线。定量范围要能覆盖全部待测的生物样品浓度范围，不得用定量范围外推的方法求算未知样品的浓度。标准曲线各浓度点的实测值与标示值之间的偏差可接受范围一般规定为最低浓度点的偏差在±20%以内，其余浓度点的偏差在±15%以内。
⑶定量下限：标准曲线上的最低浓度点，表示测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度。LLOQ 应能满足测定3～5 个消除半衰期时样品中的药物浓度或能检测出Cmax 的1／10～1／20 时的药物浓度。其准确度应在真实浓度的80%～120%范围内，相对标准差(RSD)应小于20%。
⑷精密度与准确度：一般要求选择高、中、低3 个浓度的质控样品同时进行方法的精密度和准确度考察。低浓度选择在LLOQ 的3 倍以内，高浓度接近于标准曲线的上限，中间选一个浓度。批内精密度，每一浓度至少制备并测定5 个样品。批间精密度应至少在不同天连续制备并测定3 个合格的分析批，至少45 个样品。通常用质控样品的批内和批间RSD 来考察方法的精密度。一般RSD 应小于15％，在LLOQ 附近RSD 应小于20％。准确度一般应85％～115％范围内，在LLOQ 附近应在80％～120％范围内。
⑸样品稳定性：根据具体情况，对含药生物样品在室温（1~10h）、反复冻融（至少三次，每次时间至少24h,12h,12h）或长期冰冻条件下进行稳定性考察。还应考察储备液的稳定性以及样品处理后的溶液中分析物的稳定性。
⑹提取回收率：应考察高、中、低3 个浓度的提取回收率，其结果应当精密和可重现。
⑺质控样品：高、中、低3种浓度，双质控，每个分析批至少插5％质控样品（但至少6个质控样品）。质控样品测定结果的偏差一般应小于15%，低浓度点偏差一般应小于20%，最多允许1/3 的质控样品结果超过上述限度，但不能出现在同一浓度中。
五、固相萃取法中，C18填料比较常用，请说明适用于C18填料SPE法测定的药物类型，并简述使用C18填料SPE法测定时的一般操作步骤以及各步的目的或注意事项。
1使用甲醇润湿小柱，活化填料。目的：使固相表面易于和被分析物发生分子间相互作用，并可除去填料中可能存在的杂质。注意：甲醇含量大于8%，否则将导致回收率降低。
2用水或适当的缓冲液冲洗小柱，转移过多的甲醇。目的：以便样品适当的与固相表面发生作用。注意：但清洗不宜过分，否则会使甲醇含量过低，从而导致湿润度不足，回收率降低。
3加样，使样品经过经过小柱，弃去废液。
4用水或适当的缓冲液冲洗小柱，转移样品中的内源性杂质和其他相关杂质。
5选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物，收集洗脱液，挥干溶剂以备后用或直接进行在线分析。
注意事项:1体液样品可直接上柱，体积0.1~2ml，流速1~2ml/min。2萃取碱性药物时，常加酸，有机胺或氨水，醋酸铵或离子对试剂，以减少硅醇基的吸附作用3苯基，腈基柱有一定极性，可用于正相模式。
六、简述常见生物样品的种类、特点及其前处理方式？
(1) 血液：分为血浆/血清或全血。测定血浆或血清中的药物浓度能较好反映体内药物浓度变化；若专门测定平均分布于血细胞内、外的药物浓度，则用全血；血浆采集应加入抗凝剂，离心,取上清液；血清静置，挑走血饼，离心，去上清液。处理方法有沉淀蛋白法、液液萃取法、固相萃取法。
(2) 尿样：用于药物剂量回收研究、药物尿清除率、生物利用度研究。易收集，但易受生理情况情况影响。方法：酸解或酶解可使药物从缀合物中游离出来。
(3) 唾液：易收集，采集后应立即测定除去泡沫部分的体积，放置后易分层，离心，取上清液。
(4) 组织：为药物的吸收、分布、代谢、排泄等体内过程提供重要信息。组织处理方法：匀浆化法、蛋白沉淀法，酸（碱）水解、酶水解。
(5) 头发：取样方便，无伤害，检样的掺伪可能性低，可测微量元素。头发采集后需洗涤，处理方法有提取法、有机破坏法。
(6) 其他：乳汁、精液。
七、请描述各种生物样品前处理技术的操作方式，适用范围，需要注意的问题及优缺点。
有机破坏法：一般包括湿法破坏、干法破坏及氧瓶燃烧法三种方法，适合于人发样品的破坏。破坏能力强，反应比较激烈。
直接沉淀法：将一定量生物样品加蛋白沉淀剂，涡旋，离心，取上清夜进样。当样品中待测物浓度较高，所用方法的特异性和灵敏度达到检测要求时可以考虑用直接沉淀法来处理样品。注意沉淀剂体积、沉淀剂的选择及对药物稳定性的影响（氧化、对酸不稳定）。直接沉淀法可使结合型的药物释放出来，但缺点在于容易发生乳化现象。
液液萃取法：取一定量生物样品加有机提取溶剂，涡旋，离心，取有机层，氮气吹干，流动相溶样进样。多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水相中的溶解度，而血样或尿样中的含有的大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质。用液液萃取可除去大部分杂质，从大量的样品中提取药物经浓集后用于分析。注意⑴水相pH值，⑵提取溶剂选择，⑶有机相和水相的体积。优点在于它的选择性，这依赖于有机溶剂的选择；药物能与多数内源性物质分离。缺点在于乳化现象的产生；有机溶剂易挥散、有毒性、对环保不利及不能自动化也是该法的不足之处。
固相萃取法：将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品溶液通过时，由于受到“吸附”或“分配”或“离子交换”或其它亲和力作用时，药物或杂质被保留在固定相上，用适当溶剂洗除杂质，再用适当溶剂洗脱药物。注意⑴流速，⑵装样量，⑶缓冲液pH及用量。SPE中萃取剂与样品有很大的接触面，因此可以在短时间内达到有效的萃取，可以采用动态的柱操作，可自动化；可以避免乳化的形成；柱子可弃，无污染。缺点在于价格昂贵，技术要求高，批与批之间有差异，柱子易阻塞，影响分离效果。
膜萃取：将膜看成“两相间的选择性屏障”，在膜两侧施加一驱动力时，药物就会从一侧（供给相）迁移到另一相（接受相）。供给相的流速对萃取效率有很大的影响。它不仅可以实现样品分离，由于膜材料相当多，还具有很高的选择性，而且易于实现自动化。
八、试述各种色谱-光谱联用技术在药物代谢物结构鉴定（确证）方面各有何特点？
(1) HPLC-DAD
(2) GC/MS：灵敏度高，分析快，鉴别能力强，可同时完成待测组分的分离和鉴定，适于多组分混合物中未知组分的定性定量分析。对挥发性成分可直接分析；对不挥发性热不稳定的物质，可做成适宜的挥发性衍生物再分析。
(3) LC/MS：可获得复杂混合体中单一成分的质谱图，有利于药物、药物代谢物和内源性化合物的分离和鉴定。药物代谢反应一般在母体药物结构上进行部分结构修饰，据此可对代谢物进行识别，结合其他碎片特征，对结构作合理推断。
(4) LC/NMR：将分离和结构鉴定连为一体，能提供最大量的分子结构信息。在体内药物分析中的应用主要是药物代谢产物的结构与构型研究、药物在体液中的毒性与药代动力学研究以及微生物代谢物研究。
九、试述衍生化技术在体内药物分析中的应用特点？
答：(1) 衍生化GC：极性大、挥发性低，对热不稳定的药物。目的：使极性药物变成非极性的、易于挥发的药物，使具有被分离的性质；增加药物的稳定性；提高对光学异构体的分离能力。
(2) 衍生化HPLC：对检测器不够敏感或化学不稳定的药物。目的：提高对样品检测的选择性和灵敏度、改善样品混合物的分离度、适合于进一步做结构鉴定。
(3) 衍生化LC-MS: a提高响应值，通过将易检测基团加到不检测的被测物上，增加离子化效率提高检测器的响应值；b易于结构鉴定，通过衍生化改变碰撞离子的裂解形式，得到更明确或不同的结构信息
十、请简述竞争性毛细管电泳免疫分析方法的原理。
竞争性CEIA原理：第一种：已知数量的标记抗原和有限数量的抗体与待测物混合：
Ag + Ag* + Ab(有限) = Ab-Ag + Ab-Ag* + Ag + Ag* [划线部分为两个峰，大小呈反比]
第二种：已知数量的标记抗体和有限数量的抗原与待测物混合：
Ab + Ag* + Ag(有限) = Ab-Ag + Ab-Ag* + Ab + Ab* [划线部分为两个峰，大小呈反比]
当待测物为抗原（Ag）时，抗体（Ab）的量是有限制的，将待测物，标记抗原（有限量）和抗体（有限量）混合，标记抗原和待测物就会竞争与抗体结合，反应为：Ag+Ag（标记）+Ab=Ab-Ag+Ab-Ag（标记）+Ag+Ag（标记）。检测时混合物产生两个峰，分别是Ag（标记），和Ab-Ag（标记），样品中Ag越多则游离的Ag（标记）越多，形成的Ab-Ag（标记）越少。采用一定的方法将游离抗原和抗原-抗体复合物分离，测定Ab-Ag（标记）强度，即可知道待测的浓度
十一、在体内药物分析中，常用内标法来实现定量，若现有一药物待测，需要寻找一个内标，请简述其内标的选择原则。
理想的内标化合物应与待测组分在样品制备、色谱分离和质谱检测的全过程中具有相似的行为并且对待测组分的提取、测定无任何干扰。在样品制备过程中，内标应能追踪待测组分，以校正待测物在移液、吹干、复溶等过程中的损失。在色谱分离和质谱检测过程中，内标应与待测组分的色谱和质谱行为相似，以校正待测组分由于基质效应影响所引起的响应信号的改变。
选择原则：A 与待测物仅差一个元素 B 与待测物为同系物 C 与待测物结构相似，化学性质相似
十二、比较LC-MS仪中的ESI和APCI两种离子化方式的工作原理及适用范围。
APCI工作原理是在大气压条件下采用电晕放电方式使流动相离子化，然后流动相作为化学离子化反应气使样品离子化。样品分子的离子化通过质子化或电荷转移来实现，还可以通过去质子，电子捕获及形成加和物的方式来实现。
ESI工作原理是样品溶液通过毛细管导入大气压电离源内，在气化气的帮助下和源内毛细管终端与反电极之间强电场的作用下，样品溶液形成带电荷的雾，即电喷雾。这些雾滴在热氮气流下蒸发，半径逐渐缩小，雾滴表面的电场不断增强到某一临界点时发生离子的场发射，或溶剂完全蒸发。生成的样品气相离子经质量分析器分析，测得它们的质荷比。
APCI适合于挥发性的热稳定性药物，适合非极性、中等极性的药物，适合于小分子药物的分析。
ESI适合于热不稳定性药物，适合于极性、中等极性的药物，可用于大分子药物、蛋白质、多肽的分子。
十三、试述现在液质联用仪中主要有哪几种扫描方式，特点如何，在体内药分中有何应用？
四极杆质量分析器扫描方式：
全扫描（full scan，SCAN）在给定的时间内不断地对设定荷质比（m/z）范围内所有离子进行扫描。应用：未知化合物的定性分析，测定未知混合物中各组分的分子量和质谱图。进行SIM之前，用SCAN确定扫描的目标离子及其最佳电离参数。
选择离子监测（selected ion monitoring，SIM）在给定的时间内选择性的扫描某一个或几个选定荷质比的离子，得到的不是化合物全谱。
应用：定量分析用于目标化合物的检测和在数量众多的样品中快速帅选目标化合物。优点：扫描更低的检测限，更快的速度，更好的灵敏度，更短的分析时间，适于定量。缺点：不适于定性。专属性差，可能是假阳性。故检测离子的选择很重要。
三级四极杆质量分析器扫描方式：1 SCAN和SIM 2产物离子扫描 3前体离子扫描 4中性丢失扫描（NLS） 5选择反应检测（SRM）
应用：定量分析，优点：比单级杆的SIM方式有更高的专属性（经历了两次选择）和抗干扰能力，信噪比更高，更低的检测限。
离子阱质量分析器扫描方式：全扫描，扫描离子监测，多级质谱扫描（获得结构信息的手段之一）
十五、不稳定药物的样品前处理
A易被酶水解的药物，如蛋白质多肽类：蛋白变性、酶抑制，如重金属离子、EDTA等
B易氧化的药物：加入抗氧剂，如VC+EDTA、l-半胱氨酸；2-巯基乙醇；
C易水解的药物：选择适当的溶剂；调节PH
D对光不稳定的药物，避光操作
E将不稳定药物转化为稳定药物：1)衍生化 2)更换溶剂：如酯键在甲醇和水中容易水解，可换成乙腈。3）加酯酶抑制剂：如避免被血清酯酶酶解。4）沉淀蛋白：血清酯酶也是蛋白
首过效应：药物经肠道吸收首次进入肝脏时，有些药物可被肠液或肠道上的肠菌酶破坏，或在肝内受到微粒体混合功能氧化酶代谢，使进入体循环的药量减少。
肠肝循环：药物经胃肠吸收，经胆汁分泌进入小肠或药物经吸收后在肝转化为代谢物，经胆汁分泌排入小肠，在小肠处重吸收的过程。特征为“双吸收峰”。
平衡透析法：将含药物的血浆与透析液放置于半透膜两侧，在一定温度下搅拌使其平衡。半透膜能阻挡血浆蛋白和结合药物的血浆蛋白，而游离药物自由通过半透膜并达平衡。优点：平衡状态下，结果真实可靠 缺点：受稀释作用影响，费时
超滤法：利用离心力迫使药物通过半透膜，同时血浆中水分也不断被滤除，使样品管内血浆样品不断浓缩，打破了药物与血浆蛋白结合的动态平衡。优点：设备简单，时间短，收集到足够的超滤液可直接进样 缺点：非平衡状态下测定。
液液萃取法：基于被测组分在不混溶的两种溶剂中的分配系数不同而得到分离。
固相萃取：SPE是一种吸附剂萃取，样品通过填充吸附剂的一次性萃取柱，分析物和杂质被保留在柱上，然后分别用选择性溶剂去除杂质，洗脱出分析物，从而达到分离的目的。
萃取方法选择：1较亲脂药物最好用烷基硅胶键合相省时，碱性药物用大孔树脂为佳。 2较亲水且具有酸碱性，可电离，采用离子交换树脂；3较亲水但不能解离，不易萃取，沉淀蛋白后直接进样
柱切换技术：指由阀来改变流动相走向与流动相系统,从而使洗脱液在一特定时间内从预处理柱进入分析柱的技术。
衍生化技术：在色谱过程中用特殊的化学试剂，借助化学反应给样品化合物接上某个特殊基因，使其转变为相应衍生物之后进行检测的方法。目的：1使极性药物变成非极性易挥发药物，使其具有能被分离的性质。2增加药物的稳定性。3提高对光学异构体的分离能力。
顶空气相色谱法：在封闭恒温系统中气相和凝聚相（液相或固相）存在着分配平衡，因此气相的组成能反应凝聚相的组成，用GC法来分析平衡体系中气体的方法。分为静态顶空气相色谱法和动态顶空气相色谱法。
微透析技术：实质是一种膜分离技术，利用膜透析原理，微量地对细胞液进行流动性连续采样的采样和色谱样品制备技术。
电渗流：在pH>3时，毛细管壁上的硅羟基负离子使毛细管壁内表面带负电，和溶液接触时相应的缓冲液带正电，形成双电层。在高电压作用下，双电层中水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动，该现象叫电渗流。具平面流型。
毛细管电泳免疫分析法(CEIA)：利用抗原抗体复合物与游离的抗原抗体在电泳行为上的差异，将毛细管电泳作为分离分析的手段，分为竞争性CEIA和非竞争性CEIA。
P450酶的生物学特性：1.P450酶是一个多功能的酶系.2.P450酶对底物的结构特异性3.P450酶存在有明显的种属、性别和年龄的差异.4.P450酶具有多型性和多态性.5.P450酶具有可诱导和可抑制性.
肝微粒体体外温孵法：用制备的肝微粒体辅以氧化还原辅酶（NADPH再生系统），在模拟生理条件下进行代谢反应，经一段反应时间后，采用HPLC、LC-MS和LC-MS/MS等方法对待测物进行初步分析和鉴定。
一、选择哪一种离子源？
1.电喷雾离子化（ESI）原理：通过电场使雾滴带电，然后通过离子蒸发等机制生成气相离子，再送入MS的过程。将离子由液相转至气相为强吸热过程，能量大于C-C键断裂能。但ESI可在相对低温下，逐步去溶剂化，是最软的质谱离子化方式。三个步骤：静电喷雾；去溶剂；离子蒸发。
2.大气压化学离子化（APCI原理：大气压条件下采用电晕放电使流动相离子化，然后流动相作为气相试剂使样品离子化的技术。离子化可通过质子化或电荷转移，去质子, 电子捕获及形成加合物等方式实现。
3.大气压光离子化（APPI）
ESI：通过喷口与毛细管间高压离子化，适于中、强极性化合物，特别是在溶液中能预先形成离子化合物和可以获得多个质子的大分子，对流动相组成有要求。
APCI：通过电晕针放电离子化，流动相作为化学离子化反应气，适于非极性、中等极性小分子。不适于热不稳定、难于气化的极性和大分子化合物。离子化过程对流动相组成依赖小。
APPI: 通过吸收光子而离子化，适用于有共轭基团的非极性或弱极性物质。介质效应小，对磷酸盐有很好的耐受，较ESI有较小的离子抑制。
二、待测物什么情况下需要采用衍生化, 如何选择合适的衍生化试剂？
优点：1增强离子化效率；2改变分子碎裂类型；3改善分离效果；4优化色谱行为 。
1. 小分子非极性化合物：小分子醛、酮类化合物. 对于这类化合物较难质子化。使用最多的衍生化试剂是硝基苯肼类化合物，通过引入易质子化的含氮基团和能促进雾化的疏水芳香基团来提高离子化效率。
2.小分子极性化合物：极性基团虽够有效促进待测物解离, 但是疏水结构特征对于一个待测物在离子源中的有效雾化也极其重要，并且可以使待测物在常用的反相色谱柱上得到适当保留，因此,往往需要通过衍生化的方法引入一些疏水基团以提高待测成分的离子化效率并且增加色谱保留。
a.氨基酸类:同时具有易质子化的基团(氨基)和易去质子化的基团(羧基), 在离子化过程中易发生反荷离子效应进而导致该类化合物的质谱响应极弱, 甚至没有质谱响应。
对策：通过简单的衍生化反应掩蔽羧基或氨基
b.羧酸类：一些结构较小并且极性较大的羧酸，质谱响应和色谱保留行为均不理想。
对策：使用衍生化掩蔽羧基同时引入一些离子化能力较强的基团.
c.嘌呤嘧啶拮抗物：极性很强, 且缺乏合适的离子化官能团。
常用衍生化试剂：丹酰氯 重氮甲烷 对溴苯甲酰甲基溴 （具体例子见笔记 ）
3.痕量待测物：如激素类药物的检测, 衍生化也可以作为一种提高灵敏度的重要手段。
4. 蛋白质以及多肽： 5. 不稳定化合物：如易氧化化合物
五、如何正确地认识并且科学地评价残留效应？
残留效应(carry-over effect，COE) ：指在高浓度的样品进样分析后, 在进样系统中残留了一定量的待测物, 从而影响了下一次进样时低浓度样品测定结果的准确度。
产生原因：清洗自动进样针的溶剂选择不当、洗针和进样程序设计不合理或者是进样针座吸附了待测物.
对策：1.采用甲醇-水(50:50)组成的洗针液能有效清除进样针上的残留待测物。但对疏水性极强的化合物, 采用更高比例的甲醇能更有效地消除残留效应。2. 在自动进样器中产生残留的主要部位是进样阀,通过改变进样模式消除。 评价方法：观察连续分析高浓度样品后空白溶剂或空白样品的待测物位处有无信号。若无响应信号，则判为无残留效应。若有信号且大于10%LLOQ的响应，则判断为有残留效应干扰，需改进方法；若小于10%LLOQ的响应，则判断为残留效应可忽略。
六、如何正确处理高通量分析和专属性之间的关系？
高通量 LC-MS 分析有时会导致假阳性结果, 进而降低测定结果的可靠性。
原因1：二相代谢物容易在离子源内发生中性丢失反应形成与母体药物相同的离子, 从而影响对后者的准确定量。对策：调节色谱保留使其在LC中分开后再进入MS。
原因2：质谱的专属性有时还受到其自身分辨力的限制, 尤其单个离子或是伪离子对检测时。对策：在选择检测离子/离子对时, 不仅要考虑检测对象在质谱中的绝对响应, 还应注意选择受生物基质干扰较少的监测离子或离子对,如一些小分子的中性丢失反应(如脱水反应)就不适合作为监测对象
二、何为LC-MS的介质效应？建立生物样品中药物的LC-MS测定方法时如何进行介质效应的考察？其评判标准是什么？
介质效应（ME）是指样品基质中其他成分对待测物响应值的影响。
对策：a优化改进样品提取制备方法；b优化色谱条件；调节色谱保留；改善峰形；梯度洗脱；加入添加剂c减少进样体积；d根据被测药物离子化机理选择合适的质谱接口，并优化质谱分析条件；抗基质干扰能力依次为: APPI＞APCI＞ESI；e选择合适的内标
考察：标准曲线法：本法需配制2组不同的标准曲线，每组包括5条标准曲线。第1组用流动相配制，制成含系列浓度待测组分的标准曲线。第2组标准曲线是将5种不同来源的空白生物样品(如：血浆)经提取后分别加入与第1组相同系列浓度的待测组分后制得。通过比较两组标准曲线的斜率，可以确定基质效应对定量的影响。分别求得第1组和第2组标准曲线斜率的平均值：S1和S2。
ME＝│S1－S2│/S1×100％ 若ME≤15％，则表示无介质效应或介质效应可以忽略。
ME＝S2/ S1×100%，若85%≤ME≤115％，则表示无介质效应或可以忽略。
三、分析方法验证内容与要求
⑴特异性：考察来自6个不同个体的空白生物基质，必须证明所测定物质是受试药品的原形药物或特定活性代谢物，生物样品所含内源性物质或其他代谢物及替他药物不得干扰对样品的测定。
⑵标准曲线和定量范围：配制标准样品应使用与待测样品相同生物介质，至少用6 个浓度建立标准曲线。定量范围要能覆盖全部待测的生物样品浓度范围，不得用定量范围外推的方法求算未知样品的浓度。标准曲线各浓度点的实测值与标示值之间的偏差可接受范围一般规定为最低浓度点的偏差在±20%以内，其余浓度点的偏差在±15%以内。
⑶定量下限：标准曲线上的最低浓度点，表示测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度。LLOQ 应能满足测定3～5 个消除半衰期时样品中的药物浓度或能检测出Cmax 的1／10～1／20 时的药物浓度。其准确度应在真实浓度的80%～120%范围内，相对标准差(RSD)应小于20%。
⑷精密度与准确度：一般要求选择高、中、低3 个浓度的质控样品同时进行方法的精密度和准确度考察。低浓度选择在LLOQ 的3 倍以内，高浓度接近于标准曲线的上限，中间选一个浓度。批内精密度，每一浓度至少制备并测定5 个样品。批间精密度应至少在不同天连续制备并测定3 个合格的分析批，至少45 个样品。通常用质控样品的批内和批间RSD 来考察方法的精密度。一般RSD 应小于15％，在LLOQ 附近RSD 应小于20％。准确度一般应85％～115％范围内，在LLOQ 附近应在80％～120％范围内。
⑸样品稳定性：根据具体情况，对含药生物样品在室温（1~10h）、反复冻融（至少三次，每次时间至少24h,12h,12h）或长期冰冻条件下进行稳定性考察。还应考察储备液的稳定性以及样品处理后的溶液中分析物的稳定性。
⑹提取回收率：应考察高、中、低3 个浓度的提取回收率，其结果应当精密和可重现。
⑺质控样品：高、中、低3种浓度，双质控，每个分析批至少插5％质控样品（但至少6个质控样品）。质控样品测定结果的偏差一般应小于15%，低浓度点偏差一般应小于20%，最多允许1/3 的质控样品结果超过上述限度，但不能出现在同一浓度中。
五、固相萃取法中，C18填料比较常用，请说明适用于C18填料SPE法测定的药物类型，并简述使用C18填料SPE法测定时的一般操作步骤以及各步的目的或注意事项。
1使用甲醇润湿小柱，活化填料。目的：使固相表面易于和被分析物发生分子间相互作用，并可除去填料中可能存在的杂质。注意：甲醇含量大于8%，否则将导致回收率降低。
2用水或适当的缓冲液冲洗小柱，转移过多的甲醇。目的：以便样品适当的与固相表面发生作用。注意：但清洗不宜过分，否则会使甲醇含量过低，从而导致湿润度不足，回收率降低。
3加样，使样品经过经过小柱，弃去废液。
4用水或适当的缓冲液冲洗小柱，转移样品中的内源性杂质和其他相关杂质。
5选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物，收集洗脱液，挥干溶剂以备后用或直接进行在线分析。
注意事项:1体液样品可直接上柱，体积0.1~2ml，流速1~2ml/min。2萃取碱性药物时，常加酸，有机胺或氨水，醋酸铵或离子对试剂，以减少硅醇基的吸附作用3苯基，腈基柱有一定极性，可用于正相模式。
六、简述常见生物样品的种类、特点及其前处理方式？
(1) 血液：分为血浆/血清或全血。测定血浆或血清中的药物浓度能较好反映体内药物浓度变化；若专门测定平均分布于血细胞内、外的药物浓度，则用全血；血浆采集应加入抗凝剂，离心,取上清液；血清静置，挑走血饼，离心，去上清液。处理方法有沉淀蛋白法、液液萃取法、固相萃取法。
(2) 尿样：用于药物剂量回收研究、药物尿清除率、生物利用度研究。易收集，但易受生理情况情况影响。方法：酸解或酶解可使药物从缀合物中游离出来。
(3) 唾液：易收集，采集后应立即测定除去泡沫部分的体积，放置后易分层，离心，取上清液。
(4) 组织：为药物的吸收、分布、代谢、排泄等体内过程提供重要信息。组织处理方法：匀浆化法、蛋白沉淀法，酸（碱）水解、酶水解。
(5) 头发：取样方便，无伤害，检样的掺伪可能性低，可测微量元素。头发采集后需洗涤，处理方法有提取法、有机破坏法。
(6) 其他：乳汁、精液。
七、请描述各种生物样品前处理技术的操作方式，适用范围，需要注意的问题及优缺点。
有机破坏法：一般包括湿法破坏、干法破坏及氧瓶燃烧法三种方法，适合于人发样品的破坏。破坏能力强，反应比较激烈。
直接沉淀法：将一定量生物样品加蛋白沉淀剂，涡旋，离心，取上清夜进样。当样品中待测物浓度较高，所用方法的特异性和灵敏度达到检测要求时可以考虑用直接沉淀法来处理样品。注意沉淀剂体积、沉淀剂的选择及对药物稳定性的影响（氧化、对酸不稳定）。直接沉淀法可使结合型的药物释放出来，但缺点在于容易发生乳化现象。
液液萃取法：取一定量生物样品加有机提取溶剂，涡旋，离心，取有机层，氮气吹干，流动相溶样进样。多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水相中的溶解度，而血样或尿样中的含有的大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质。用液液萃取可除去大部分杂质，从大量的样品中提取药物经浓集后用于分析。注意⑴水相pH值，⑵提取溶剂选择，⑶有机相和水相的体积。优点在于它的选择性，这依赖于有机溶剂的选择；药物能与多数内源性物质分离。缺点在于乳化现象的产生；有机溶剂易挥散、有毒性、对环保不利及不能自动化也是该法的不足之处。
固相萃取法：将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品溶液通过时，由于受到“吸附”或“分配”或“离子交换”或其它亲和力作用时，药物或杂质被保留在固定相上，用适当溶剂洗除杂质，再用适当溶剂洗脱药物。注意⑴流速，⑵装样量，⑶缓冲液pH及用量。SPE中萃取剂与样品有很大的接触面，因此可以在短时间内达到有效的萃取，可以采用动态的柱操作，可自动化；可以避免乳化的形成；柱子可弃，无污染。缺点在于价格昂贵，技术要求高，批与批之间有差异，柱子易阻塞，影响分离效果。
膜萃取：将膜看成“两相间的选择性屏障”，在膜两侧施加一驱动力时，药物就会从一侧（供给相）迁移到另一相（接受相）。供给相的流速对萃取效率有很大的影响。它不仅可以实现样品分离，由于膜材料相当多，还具有很高的选择性，而且易于实现自动化。
八、试述各种色谱-光谱联用技术在药物代谢物结构鉴定（确证）方面各有何特点？
(1) HPLC-DAD
(2) GC/MS：灵敏度高，分析快，鉴别能力强，可同时完成待测组分的分离和鉴定，适于多组分混合物中未知组分的定性定量分析。对挥发性成分可直接分析；对不挥发性热不稳定的物质，可做成适宜的挥发性衍生物再分析。
(3) LC/MS：可获得复杂混合体中单一成分的质谱图，有利于药物、药物代谢物和内源性化合物的分离和鉴定。药物代谢反应一般在母体药物结构上进行部分结构修饰，据此可对代谢物进行识别，结合其他碎片特征，对结构作合理推断。
(4) LC/NMR：将分离和结构鉴定连为一体，能提供最大量的分子结构信息。在体内药物分析中的应用主要是药物代谢产物的结构与构型研究、药物在体液中的毒性与药代动力学研究以及微生物代谢物研究。
九、试述衍生化技术在体内药物分析中的应用特点？
答：(1) 衍生化GC：极性大、挥发性低，对热不稳定的药物。目的：使极性药物变成非极性的、易于挥发的药物，使具有被分离的性质；增加药物的稳定性；提高对光学异构体的分离能力。
(2) 衍生化HPLC：对检测器不够敏感或化学不稳定的药物。目的：提高对样品检测的选择性和灵敏度、改善样品混合物的分离度、适合于进一步做结构鉴定。
(3) 衍生化LC-MS: a提高响应值，通过将易检测基团加到不检测的被测物上，增加离子化效率提高检测器的响应值；b易于结构鉴定，通过衍生化改变碰撞离子的裂解形式，得到更明确或不同的结构信息
十、请简述竞争性毛细管电泳免疫分析方法的原理。
竞争性CEIA原理：第一种：已知数量的标记抗原和有限数量的抗体与待测物混合：
Ag + Ag* + Ab(有限) = Ab-Ag + Ab-Ag* + Ag + Ag* [划线部分为两个峰，大小呈反比]
第二种：已知数量的标记抗体和有限数量的抗原与待测物混合：
Ab + Ag* + Ag(有限) = Ab-Ag + Ab-Ag* + Ab + Ab* [划线部分为两个峰，大小呈反比]
当待测物为抗原（Ag）时，抗体（Ab）的量是有限制的，将待测物，标记抗原（有限量）和抗体（有限量）混合，标记抗原和待测物就会竞争与抗体结合，反应为：Ag+Ag（标记）+Ab=Ab-Ag+Ab-Ag（标记）+Ag+Ag（标记）。检测时混合物产生两个峰，分别是Ag（标记），和Ab-Ag（标记），样品中Ag越多则游离的Ag（标记）越多，形成的Ab-Ag（标记）越少。采用一定的方法将游离抗原和抗原-抗体复合物分离，测定Ab-Ag（标记）强度，即可知道待测的浓度
十一、在体内药物分析中，常用内标法来实现定量，若现有一药物待测，需要寻找一个内标，请简述其内标的选择原则。
理想的内标化合物应与待测组分在样品制备、色谱分离和质谱检测的全过程中具有相似的行为并且对待测组分的提取、测定无任何干扰。在样品制备过程中，内标应能追踪待测组分，以校正待测物在移液、吹干、复溶等过程中的损失。在色谱分离和质谱检测过程中，内标应与待测组分的色谱和质谱行为相似，以校正待测组分由于基质效应影响所引起的响应信号的改变。
选择原则：A 与待测物仅差一个元素 B 与待测物为同系物 C 与待测物结构相似，化学性质相似
十二、比较LC-MS仪中的ESI和APCI两种离子化方式的工作原理及适用范围。
APCI工作原理是在大气压条件下采用电晕放电方式使流动相离子化，然后流动相作为化学离子化反应气使样品离子化。样品分子的离子化通过质子化或电荷转移来实现，还可以通过去质子，电子捕获及形成加和物的方式来实现。
ESI工作原理是样品溶液通过毛细管导入大气压电离源内，在气化气的帮助下和源内毛细管终端与反电极之间强电场的作用下，样品溶液形成带电荷的雾，即电喷雾。这些雾滴在热氮气流下蒸发，半径逐渐缩小，雾滴表面的电场不断增强到某一临界点时发生离子的场发射，或溶剂完全蒸发。生成的样品气相离子经质量分析器分析，测得它们的质荷比。
APCI适合于挥发性的热稳定性药物，适合非极性、中等极性的药物，适合于小分子药物的分析。
ESI适合于热不稳定性药物，适合于极性、中等极性的药物，可用于大分子药物、蛋白质、多肽的分子。
十三、试述现在液质联用仪中主要有哪几种扫描方式，特点如何，在体内药分中有何应用？
四极杆质量分析器扫描方式：
全扫描（full scan，SCAN）在给定的时间内不断地对设定荷质比（m/z）范围内所有离子进行扫描。应用：未知化合物的定性分析，测定未知混合物中各组分的分子量和质谱图。进行SIM之前，用SCAN确定扫描的目标离子及其最佳电离参数。
选择离子监测（selected ion monitoring，SIM）在给定的时间内选择性的扫描某一个或几个选定荷质比的离子，得到的不是化合物全谱。
应用：定量分析用于目标化合物的检测和在数量众多的样品中快速帅选目标化合物。优点：扫描更低的检测限，更快的速度，更好的灵敏度，更短的分析时间，适于定量。缺点：不适于定性。专属性差，可能是假阳性。故检测离子的选择很重要。
三级四极杆质量分析器扫描方式：1 SCAN和SIM 2产物离子扫描 3前体离子扫描 4中性丢失扫描（NLS） 5选择反应检测（SRM）
应用：定量分析，优点：比单级杆的SIM方式有更高的专属性（经历了两次选择）和抗干扰能力，信噪比更高，更低的检测限。
离子阱质量分析器扫描方式：全扫描，扫描离子监测，多级质谱扫描（获得结构信息的手段之一）
十五、不稳定药物的样品前处理
A易被酶水解的药物，如蛋白质多肽类：蛋白变性、酶抑制，如重金属离子、EDTA等
B易氧化的药物：加入抗氧剂，如VC+EDTA、l-半胱氨酸；2-巯基乙醇；
C易水解的药物：选择适当的溶剂；调节PH
D对光不稳定的药物，避光操作
E将不稳定药物转化为稳定药物：1)衍生化 2)更换溶剂：如酯键在甲醇和水中容易水解，可换成乙腈。3）加酯酶抑制剂：如避免被血清酯酶酶解。4）沉淀蛋白：血清酯酶也是蛋白
