篇一 :分子克隆实验步骤总结

分子克隆实验步骤

1. 对目的片段进行pcr扩增:

Pcr体系:(50?L)

DNA Template: 10-100ng

10×PCR buffer: 5?L

50mM dNTPs: 0.5?L

Primers: 1?M each

Water: add to 49?L

Taq Polymerase: 1?L

2.琼脂糖电泳,看有无目的条带

3.对目的条带进行切胶回收

4.对pcr产物加尾: 72℃,20min(如用高保真酶,则需加尾;则无需加尾)

加尾体系:(10?L)

胶回收DNA: 8?L

Buffer: 1?L

dNTPmix: 0.5?L

Taq Polymerase: 0.5?L

5.T载体连接:室温,30min

体系:(6?L)

加尾后产物: 4?L

T载体: 1?L Taq酶,

Salt solution 1?L

6.30-40?L感受态加入重组后的质粒。

7.放冰上30min。

8.42℃热击90s(放冰上冷:1-2min)

9. 加SOC(200-250?L)

10.37℃,300rpm,1h

11.平板涂布:加氨苄的培养基,37℃培养箱倒置培养过夜

12.挑单菌落:用牙签挑单菌落,放到含6mL液体培养基的试管中,

37℃摇床培养过夜

13.试剂盒提质粒

14.酶切:37℃,2h

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篇二 :分子克隆经验谈

分子克隆经验谈

做了快一年的分子克隆,犯了很多错误,经历了很多坎坷,也学到了很多东西。分子克隆过程中出现问题最多的大概就是连接了,大家抱怨的也最多,我也陷入在个步骤上很久。经过长时间的摸索我在连接这个问题上有一些体会,在这里跟大家分享一下我的经验,以供和我一样陷入困境及刚开始做克隆的同学参考。

关于连接的提问多集中在连接的体系、DNA的用量、vector和insert的比例、连接酶等。但是我认为,连接不成功,问题并不一定出在连接这步上。

有很多环节影响连接的成败,如酶切的好不好、回收的质量好坏、连接时的浓度或比例、感受态等。以下我详细说明。

1, PCR引物的设计。

通俗的不说,需要指出的是设计引物时一定要考虑切点的甲基化问题。做普通的克隆会涉及到甲基化形式有两种:dam甲基化和dcm甲基化。常用的大肠杆菌都有这两种甲基化酶。dam甲基化酶识别GATC位点并甲基化;dcm甲基化酶识别CCWGG位点(W是A或T)并甲基化。如果有这两种位点那么多数情况内切酶是切不开了。容易受甲基化影响的内切酶有:Dpn1(GA/TC)天生就甲基化;Cla1(ATC/GAT)如果前面加个G或后面加个C那么恭喜你,dam甲基化;Xba1(T/CTAGA)如果前面加个GA或后面加个TC也是dam甲基化,等等有好多。这些容易甲基化的切点设计引物时一定要注意,避免引入甲基化位点。 如果真是避免不了或者后来才发现问题,那么把甲基化的质粒转化到甲基化酶缺陷型大肠杆菌中再提质粒就没有甲基化,可以切了。甲基化缺陷型菌有:DM1(Invitrogen)、INV110(invitrogen)、JM110等。

2,PCR产物。

两种方式:一种纯化后直接酶切连接;一种连T载体再往下切连接。我个人强烈建议第二种,连T载体。因为PCR产物直接酶切我觉得有两个缺点:①由于两头把手太短,虽说有保护碱基,但我觉得还是不如从质粒上往下切好切,而且容易切坏、切碎;②无法从电泳上看出来切没切开,因为也就切下了几个十几个bp,带形没啥变化。连T载体的优点:①进载体后,大提一次的质粒夸张点说够用一辈子的,不用总PCR往出调了,再说PCR那东西还不太稳定,一把多一把少的。②酶切会很清晰,切下来了就是有带,没切动就是没有,没连上也能知道不是没切开而是别的步骤有问题。

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篇三 :分子克隆全过程

本文以大肠杆菌DH10B为例介绍外源基因在大肠杆菌中表达全过程

克隆步骤包括:模板制备(基因组DNA提取)-感受态细胞的制备-PCR-纯化回收-酶切-连接-转化-挑菌摇菌-质粒抽提-酶切鉴定-测序

1) 基因组DNA提取(以家蚕为例)

1. 取家蚕五龄后部丝腺约0.5g,于10ml匀浆器内,加2mlDNA抽提缓冲液,在

冰上充分研磨,转入5ml的离心管;

2. 加入RnaseA(10ul)至终浓度20ug/ml,37℃水浴1h;

3. 加入ProteinaseK(25ul)至终浓度100ug/ml,55℃水浴2h;

4. 分装到1.5ml eppendorff管,0.6ml/管;

5. 加入等体积的平衡酚(pH8.0),充分混匀,5000g,15min,取上清;

6. 重复5,再抽提1次;

7. 用等体积的酚/氯仿(1/1,v/v),氯仿各抽提1次

8. 将上清移入新离心管,加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH 5.2),2倍体积的

无水乙醇,充分混匀,4℃过夜

9. 用牙签将絮状沉淀物挑出。用75%冰酒精洗涤3次,37℃控干;

10. 200?l 0.1?TE(pH8.0)溶解DNA;

11. 检测OD值;

12. 做好标记,以供进一步实验之用。

2) 感受态细胞的制备

1. -20℃冻藏的DH10B甘油菌在LB平板上复苏(划板),37℃,8-12小时;

2. 用灭菌牙签挑取单菌落,放入3ml LB培养基中,37℃振荡培养过夜;

3. 取100μl过夜培养物接种到另一3 ml LB培养基中,37℃振荡培养2?2.5 h,

使OD值在0.6左右(把握好浓度,OD值可以不用测);将菌液分装到1.5ml EP管中(在超净台完成)

4. 5000 g离心4 min收集菌体,将菌体重悬于800 μl 75 mmol/L冷CaCl2中,

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篇四 :分子克隆实验报告

实验名称  分子克隆、分子杂交、基因表达检测                             

实验类型      综合性                            

指导教师      李一博                            

班级           A                                

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篇五 :7年分子克隆经验

7年分子克隆经验

1,PCR引物的设计。

通俗地说,很多人用了很多软件设计来设计去,又是考虑发夹结构,又是考虑二聚体,又是考虑Tm值,折腾来折腾去,但其实没那么复杂。首先保证你要的基因是正确的,这个可以从NCBI中找到,大部分是没问题的,然后再找到起始密码子,从那开始大概上游取20-27bp,加上酶切位点,加上保护碱基(一般3个)就是上游引物,取后20-27bp碱基,反向互补,加上酶切位点和保护碱基组成下游引物。这样引物设计就完成了,可以放到软件里看看GC含量,Tm值,发夹结构,二聚体等,适当调整碱基个数和保护碱基的个数。需要额外注意的是移码问题。

需要指出的是设计引物时一定要考虑切点的甲基化问题。做普通的克隆会涉及到甲基化形式有两种:dam甲基化和dcm甲基化。常用的大肠杆菌都有这两种甲基化酶。dam甲基化酶识别GATC位点并甲基化;dcm甲基化酶识别CCWGG位点(W是A或T)并甲基化。如果有这两种位点那么多数情况内切酶是切不开了。容易受甲基化影响的内切酶有:Dpn1(GA/TC)天生就甲基化;Cla1(ATC/GAT)如果前面加个G或后面加个C那么恭喜你,dam甲基化;Xba1(T/CTAGA)如果前面加个GA或后面加个TC也是dam甲基化,等等有好多。这些容易甲基化的切点设计引物时一定要注意,避免引入甲基化位点。如果真是避免不了或者后来才发现问题,那么把甲基化的质粒转化到甲基化酶缺陷型大肠杆菌中再提质粒就没有甲基化,可以切了。甲基化缺陷型菌有:DM1(Invitrogen)、INV110(invitrogen)、JM110等。

2,PCR产物。

两种方式:一种纯化后直接酶切连接;一种连T载体再往下切连接。我个人强烈建议第二种,连T载体。因为PCR产物直接酶切我觉得有两个缺点:①由于两头把手太短,虽说有保护碱基,但我觉得还是不如从质粒上往下切好切,而且容易切坏、切碎;②无法从电泳上看出来切没切开,因为也就切下了几个十几个bp,带形没啥变化。连T载体的优点:①进载体后,大提一次的质粒夸张点说够用一辈子的,不用总PCR往出调了,再说PCR那东西还不太稳定,一把多一把少的。②酶切会很清晰,切下来了就是有带,没切动就是没有,没连上也能知道不是没切开而是别的步骤有问题。连T载体也有些麻烦的地方,如需要的切点有时跟T载体上自带的切点冲突,这就要小心鉴别;而且连T载体最好测序看一下PCR的产物对不对、切点对不对。总体来讲连T载体是很有优势的。

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篇六 :分子生物学总结

名词解释:

1 分子生物学:是一门从分子水平研究生命现象、生命本质、生

命活动及其规律的科学。广义是指以核酸和蛋白质等生物大分子

的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象,从

分子水平阐明生命现象和生物学规律。狭义是指研究基因或DNA

的复制转录和调控等过程的学科

2 医学分子生物学:是分子生物学的一个重要分支,又是一门新

兴交叉学科。它是从分子水平上研究人体在正常和疾病状态下的

生命活动及其规律,从分子水平开展人类疾病的预防、诊断和治

疗研究的一门科学。

3酶工程:过去主要是通过生物化学方法从各种材料中提取、制

备酶制剂。现在主要应用基因工程技术制取酶制剂。 1 17 启动子:是RNA聚合酶结合的区域,操纵基因实际上不是一个基因,而是一段能被特异阻遏蛋白识别和结合的DNA序列。 18 质粒:是细菌细胞内携带的染色体外的DNA分子,是共价闭合的环状DNA分子,能独立进行复制。 19 质粒的不相容性:具有相同复制起始位点和分配区的两种质粒不能共存于一个宿主菌,这种现象称为质粒的不相容性。 20 转位因子:即可移动的基因成分,是指能够在一个DNA分子内部或两个DNA分子之间移动的DNA片段。 20自私DNA:核生物基因组中也存在一些可移动的遗传因素,这些DNA顺序并无明显生物学功能,似乎为自己的目的而组织,故有自私DNA之称。 4蛋白质工程:过去主要是采用化学方法对纯化的蛋白质进行结构21 自杀基因:将某些细菌、病毒和真菌中特异性的基因转导入肿瘤改造,制备出有特定功能的蛋白质。现在主要应用基因工程技术,细胞,此基因编码的特异性酶类能将原先对细胞无毒或毒性极低的从改造目的基因的结构入手,在受体细胞中表达不同结构的蛋白

前体物质在肿瘤细胞内代谢成毒性物质,达到杀死肿瘤的目的,这质。

5微生物工程:又称发酵工程是利用微生物特定性状,使微生物

产生有用物质或直接用于工业化生产的技术。

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篇七 :分子克隆——主要步骤

笔记3(分子克隆2——主要步骤)

分子克隆可以分为以下几个步骤:

分子克隆主要步骤

分子克隆主要步骤

分子克隆主要步骤

分子克隆主要步骤

分离制备待克隆的DNA片段————将靶DNA片段与载体在体外进行连接————重组DNA分子转入宿主细胞————筛选、鉴定阳性重组子————重组子的扩增。

1.带有目的基因的DNA片段的获得: 可以用限制内切酶降解基因组DNA,再配合使用其他实验手段得到待定的DNA片段,可以用超速离心的方法分离出具有特定核苷酸组成的DNA片段,可以用mRNA做模板,用反转录酶合成互补DNA,即cDNA,也可以用化学合成的方法直接合成一段DNA。

2.重组DNA分子的构建:

重组DNA分子中包括两部分,一部分是外源DNA,即目的DNA片段,另一部分是载体DNA。用作载体的,有质粒、噬菌体或病毒DNA。它们的基本特征是能够独立复制。如果用同一种限制性内切酶切割这两种DNA,则它们的末端完全相同,由于有互补的单链末端序列存在,在连接酶的作用下,就可以形成重组DNA分子。在没有互补单链末端的情况下,也可以用酶学方法造成一个互补单链末端之后再进行连接。

3.重组DNA分子的转化和重组克隆的筛选:

重组DNA分子必须进入宿主细胞中,才能得到扩增和表达.这个过程叫做转化。大肠杆菌是目前使用最广泛的宿主细胞。除此以外.其他细菌、酵母、哺乳动物细胞等也可作为宿主细胞,可以根据实验的需要加以选择。在被转化的宿主细胞中,不同的单个细胞(在平板上表现为单个菌落,亦称克隆)中可能含有不同的重组质粒或非重组质粒,因此必须进行筛选,以便确定哪些是重组克隆。筛选可以使用抗菌素抗性或其他方法,依载体的性质而定。

4.特定重组克隆的鉴别:

由于重组克隆往往是较多的,而在某一克隆实验中,我们感兴趣的目的克隆只有一个或几个,所以需要进一步鉴别。使用的方法主要有核酸杂交法和免疫化学法。

此外,找出了目的克隆之后,还需要根据实验的目的,进一步弄清目的克隆中外源DNA片段上的基因的结构和功能。主要有酶切图谱的制定,基因在DNA片段上的精确定位,确定是否有内含子,DNA序列分析,离体翻译实验,外源基因在某些宿主细胞中的表达及产物的提纯等。

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篇八 :分子克隆步骤

分子克隆流程及步骤

1 PCR扩增目的基因片段

模板 1μL -20℃小提质粒的盒子

引物1(10μmol)1μL -20℃标有引物的盒子

100μL体系 引物2 (10μmol)1μL 物品位置: -20℃标有引物的盒子

2×Taq mix 50μL -20℃分子克隆工具酶1 Pfu高保真酶 1μL 分子克隆工具酶1

dd水 46μL 4℃冰箱长盒子中

PCR 循环:94℃ 5min-----94℃ 1min----59℃ 1min----72℃ 1min-----72℃ 1min-----4℃ 2h

变性反应 延伸反应 保存

30 cycle

注:1 HS Mix 与 Taq mix 一样;

2 PCR盖子温度 94 ℃;

3 退火温度视不同引物碱基,公式为:T=2(G+C)+(A+T)最适合温度为T的上下2-5℃;

4 PCR产物保存在4℃,过夜则保存在-20℃

2 PCR 扩曾产物的凝胶电泳,拍照

为了检验PCR的扩增结果需对其进行琼脂糖凝胶电泳分析。(电压8V/cm,电泳槽正负极

间距离)

取出5-6μL样品于电泳槽中,DNA marker 3-5μL,电泳至过凝胶1/2在紫外下观察,必

要时拍照。注意电泳时的正负极,DNA和蛋白质都是从负极向正极跑。电压的控制为8V/cm,

大槽一般电压为小胶100V,大胶160V,小槽电压一般为80V。

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