分子克隆实验步骤
1. 对目的片段进行pcr扩增:
Pcr体系:(50?L)
DNA Template: 10-100ng
10×PCR buffer: 5?L
50mM dNTPs: 0.5?L
Primers: 1?M each
Water: add to 49?L
Taq Polymerase: 1?L
2.琼脂糖电泳,看有无目的条带
3.对目的条带进行切胶回收
4.对pcr产物加尾: 72℃,20min(如用高保真酶,则需加尾;则无需加尾)
加尾体系:(10?L)
胶回收DNA: 8?L
Buffer: 1?L
dNTPmix: 0.5?L
Taq Polymerase: 0.5?L
5.T载体连接:室温,30min
体系:(6?L)
加尾后产物: 4?L
T载体: 1?L Taq酶,
Salt solution 1?L
6.30-40?L感受态加入重组后的质粒。
7.放冰上30min。
8.42℃热击90s(放冰上冷:1-2min)
9. 加SOC(200-250?L)
10.37℃,300rpm,1h
11.平板涂布:加氨苄的培养基,37℃培养箱倒置培养过夜
12.挑单菌落:用牙签挑单菌落,放到含6mL液体培养基的试管中,
37℃摇床培养过夜
13.试剂盒提质粒
14.酶切:37℃,2h
…… …… 余下全文