试剂耗材：

10%绵羊红细胞，1:20补体（新鲜豚鼠血清）由生物技术实验室提供。 酶标板，美国corning公司生产。

仪器设备：

酶标仪，奥地利生产，anthos2010型。

移液器，美国热电公司生产。

水浴锅，常州国华仪器设备有限公司生产，SHA-B型。

实验方法：

1. 将待测血清用PBS缓冲液稀释200倍备用。

2. 在酶标板中分别加入10%绵羊红细胞、1:20补体、待测血清各50?l，混匀后37℃水浴锅中水浴30min。

3. 从水浴锅中取出酶标板，置离心机中1500转/分，离心10min。

4. 另取一块酶标板，将离心后的上清液转移至另一酶标板中进行吸光度检测。

5. 用酶标仪于540nm波长处检测样本的吸光度值。

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实验 小鼠血清溶血素含量测定

一、血清溶血素（抗体）分光光度检测法

【实验原理】

抗原（绵羊红细胞，即SRBC）进入机体，刺激机体产生特异性抗体（溶血素，即抗SRBC抗体）；抗原抗体在体内外结合形成抗原抗体复合物，暴露出补体的C1q结合点，激活补体，导致绵羊红细胞溶解。通过检查机体产生抗体的量，

反映机体的免疫功能状态。

【实验目的】

掌握血清抗体（溶血素）含量的测定方法。

【试剂与器材】

1．小鼠，绵羊红细胞，补体；

2．都氏试剂或蒸馏水；

3．试管，吸管，钳子，镊子，微量加样器，水浴箱，分光光度计（540nm）。

【操作方法】

1．把SRBC用生理盐水洗3次（1000～2000转/分，5分钟），弃上清，3﹕5（V/V）用生理盐水稀释SRBC浓度约为20亿个/ml。

2．实验前4天，每鼠腹腔注射SRBC0.2ml；

3．免疫4天后取血，分离血清；

4．用生理盐水适当稀释血清（200倍左右）；

5．取1ml稀释后的血清加入反应管，再加0.5ml10%SRBC，置冰浴中，每管加入1ml补体；

6．将反应管移至37℃水浴中，10分钟后再把其移至冰浴中；

7．2000转/分离心10分钟，再取上清1ml，加入3ml都氏试剂（或蒸馏水）混匀，10分钟后用分光光度计（540mn）测定吸光度；

8．另取一试管作测定实验用的SRBC半数溶血时的吸光度值。取同实验用的10%SRBC0.25ml，加4ml都氏试剂，摇匀，10分钟后用分光光度计测定吸光度。

【结果】

按下式计算样品的半数溶血值HC50：

样品的吸光度值

样品HC50= SRBC半数溶血时的吸光×稀释倍数

度值

【注意事项】

在操作过程中，严格遵守冰浴时间，以控制反应时间的一致性。

【作业】

计算出样品的溶血素值。

附：

二、微量溶血检测法

（一）实验原理

同血清溶血素分光光度检测法。

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生命学院09级分子生物学实验报告

目录：

实验一 质粒 DNA 的小量制备（P2-P4）

实验二 DNA 的含量、纯度与分子量的电泳法测定（P4-P7）

实验三 感受态细胞的制备及转化（P7-P9）

实验一  质粒DNA的小量制备

一、实验目的

1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。

2．了解制备原理及各种试剂的作用。

3. 制取质粒以备大肠杆菌的培养和电泳。

二、实验材料及试剂

材料：大肠杆菌E.coli，含pBR322质粒。

试剂：

1.   LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，用NaOH调pH至7.3左右。如固体培养基则添加15g/L琼脂。

2.   溶液Ⅰ（pH8.0G.E.T缓冲液）：50 mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA。灭菌后存放。

3.   溶液Ⅱ（0.2mol/LNaOH(内含1％SDS)）：预先配制1％SDS母液，临用前一天晚上加入0.2mol/LNaOH，4℃保存。

4.   溶液Ⅲ（pH4.8乙酸钾溶液）：5mol/L乙酸钾60mL、冰乙酸11.5mL、双蒸馏水28.5mL。

5.   酚/氯仿液(V/v＝1/1)：酚为重蒸酚，配制时，先将氯仿中加入异戊醇，使其体积比为24:1，然后等量的加入重蒸酚，混匀，并用0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，于棕色瓶中存放，并在上面覆盖等体积的0.01 mol/LTris-HCl(pH7.6)，4℃保存。

6.   无水乙醇

7.   70％乙醇

8.   pH8.0 TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA，其中含RNA酶20μg/mL。

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分子生物学实验报告

专业：******     班级：*** 指导老师：**

   学生姓名：***

 目录：

 实验一  质粒DNA的小量制备

 实验二  DNA的含量、纯度与分子量的电泳法测定

 实验三  感受态细胞的制备及转化

 实验四  PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测

                               2010.05.29

                                

分子生物学基础实验

分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。   

实验一  质粒DNA的小量制备

一、实验原理

   要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc^r），抗新霉素基因（Ne^r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。

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试验中需要查阅的问题以及答案

1 脱钙：（1）盐酸的理论用量（2）所用盐酸的浓度，及反应时间，并说明其对最终质量有什么影响？

2 脱乙酰：（1）甲壳质 （2）壳聚糖是甲壳质的一种衍生物，它具

有什么特点或特征。《易溶于酸的溶解性，抗菌性，成膜

性，成纤性，吸附剂等等》

（3） 用途（4） 衍生物？ 糖性质

（5） 工艺参数：氢氧化钠的浓度，时间，浓度，产品质

量。

（6） 质量指标：《分子量》,《脱乙酰度》

（7）如何制取高脱乙酰度的壳聚糖？

（8）如何获得低分子量的，如壳寡糖？

3 脱蛋白：（1）如何检验脱蛋白是否完全？

（2）蛋白质如何回收？

4 脱色：（1）氧化脱色《高锰酸钾，过氧化氢》

(2)如何除掉过量的氧化剂？

5 废水的处理问题？

6 （1）在脱乙酰度中，除了用盐酸和氢氧化钠酸碱滴定的方法，还有没有其他方法？

(2) 分子量的测试方法 1%的溶液（1%的乙酸） ，测旋转粘度。在其过程中不能加热，为什么？

7 脱钙：怎么检测脱钙完全，如何回收钙？

㈠ .脱蛋白是否完全的检验的检验

双缩脲试剂是由双缩脲试剂A和双缩脲试剂B两种试剂组成.

双缩脲试剂A的成分是氢氧化钠的质量分数为0.1 g/mL的水溶液； 双缩脲试剂B的成分是硫酸铜的质量分数为0.01 g/mL的水溶液。 双缩脲试剂可以验证蛋白质的存在。

具体方法是： 先将双缩脲试剂A加入组织样液，摇荡均匀（必须营造碱性环境），在加入双缩脲试剂B，摇荡均匀。如果组织里含有蛋白质，那么会看到溶液变成紫色。具有两个或两个以上肽键的化合物皆可与双缩脲试剂产生紫色反应。蛋白质的肽键在碱性溶液中能与Cu2+络合成紫红色的化合物。颜色深浅与蛋白质浓度成正比。

双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。

双缩脲试剂本是用来检测双缩脲，因蛋白质中也有-CONH-基也可用于检验蛋白质，与蛋白质接触后的颜色呈紫色。

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临床输血与检验创新性实验设计

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抗原与免疫血清的制备

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抗体是机体接受抗原刺激后产生的一种具有免疫特异性的球蛋白。在免疫学实践中，为制备抗体常以抗原性物质（细菌、病毒、类毒素、血清及其他蛋白质）给动物注射。经过一定时间后，动物血清中可以产生大量的特异性抗体。这种含有特异性抗体的血清称为免疫血清或者抗血清。

免疫血清的制备是一项常用的免疫学技术，高效价，高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂（如用于制备免疫标记抗体等），也可供特异性免疫治疗用^[1]。免疫血清的效价高低取决于实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性。如以免疫原性强的抗原刺激高应答性的机体，常可获得高效价的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫时，则需同时加用佐剂以增强抗原的免疫原性。免疫血清的特异性主要取决于免疫用抗原的纯度。因此，如欲获得高特异性的免疫血清，必须予先纯化抗原。此外，抗原的剂量、免疫途径及注射抗原的时间间隔等，也是影响免疫血清效价的重要因素应予重视。

在本实验中采用ELISA法和凝集反应的原理来测定免疫血清的效价：

ELISA测定的原理是利用标记技术将酶标记到抗体（抗原）上，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记抗体（抗原）发生特异性反应。在遇到相应的酶底物时，酶能高效、专一催化、分解底物，生成有颜色的产物。根据颜色的深、浅、可以判断待检物中有无特异的抗原（抗体）以及量的大小。该方法可对待检样品进行定性和定量分析；同时具有微量、特异、高效、经济、简便等优点，因此是一种广泛应用于生物和医学领域的微量测定技术。

凝集反应是一种经典的抗原抗体反应，也是高等医学院校学生免疫学实验的重要内容之一，它是指可溶性抗原及其相应抗体在一定条件下出现肉眼可见的沉淀物的现象^[2]。凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类。前者可利用已知抗血清鉴定未知细菌，优点是极端快速，为诊断肠道传染病时鉴定病人标本中肠道细菌的重要手段；后者是一种定量法，现已发展成微量滴定凝集法，它可利用已知抗原测定人体内抗体的水平(效价)，也是诊断肠道传染病的重要方法。免疫血清的效价高低取决于实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性。机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产生体液免疫（抗体）和细胞免疫（致敏的T淋巴细胞及其产物多种淋巴因子）的过程。这种结合反应的特异性可能是生物学中已知的最特异的反应^[3]。

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