海带多糖的提取和鉴定实验报告

—0943713 王欢 

实验伙伴：0943623魏爽

蛋白质、酶、核酸、多糖等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题。为了进行结构与功能的研究，首先必须解决制备问题，制备完毕要进行鉴定。

一、实验目的

1，掌握酶法提取海带硫酸多糖的原理和操作流程；

2，了解多糖物质的常规纯化方法及原理；

3，熟悉多糖含量测定的常用方法和原理；

4，掌握硫酸－蒽酮法测定多糖的原理及操作流程、注意事项；

二、实验原理

本实验综合利用细胞匀浆和纤维素酶水解，破碎海带细胞壁，释放细胞内容物，包括多糖、海藻酸以及蛋白、核酸等；随后通过海藻酸与Ca²⁺的结合沉淀形成不溶性海藻酸钙，以去除其中的海藻酸；继而通过CTAB与多糖络合后溶解度下降的特性，将多糖与其他成份分离；最后在盐溶液中回溶多糖，并通过乙醇沉淀法获得多糖沉淀，即为海带粗多糖。可采用硫酸－蒽酮法测定多糖的含量

三、实验材料及试剂

实验材料：干海带

实验试剂：纤维素酶、1mol/L氯化钙溶液、硫酸、蒽酮、 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、 葡萄糖、 DE-23、DE-41、Sepharose(2B 4B 6B)等

仪器：组织匀浆机、水浴锅、台式高速离心机、分光光度计等

(下面是一些仪器和设备的照片)

四、实验步骤

海带多糖的提取

1．干海带加水浸泡过夜，充分溶胀后，加入1/3体积的水，放入组织匀浆机中，粉碎成海带浆。取约100ml海带浆，调PH值为4.5-5.0，加入0.3g纤维素酶，于50度温浴水解4-6小时，间或搅拌，促进细胞壁水解。（这个过程我们的指导老师已经提前做好）

2..在海带浆中加入50ml水，搅拌均匀，沸水浴5min，使纤维素酶失活，冷至室温，用6层纱布过滤，收集滤液（注：1、这个时候一定不要混入海带渣，防止对后面测量结果的影响， 2、过滤过程中可戴手套挤纱布，但是不要太用力使海带渣意外流出）

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 蔗糖的转化

                                     1319班  张柳君  201340176

【实验目的】

1. 测定蔗糖转化反应的速率常数和半衰期。

2. 了解旋光仪的构造、工作原理，掌握旋光仪的使用方法。

【实验原理】

蔗糖转化反应为： C₁₂H₂₂O₁₁ + H₂O → C₆H₁₂O₆   + C₆H₁₂O₆

蔗糖            葡萄糖     果糖

为使水解反应加速，常以酸为催化剂，故反应在酸性介质中进行。由于反应中水是大量的，可以认为整个反应中水的浓度基本是恒定的。而H^＋是催化剂，其浓度也是固定的。所以，此反应可视为准一级反应。其动力学方程为

                                  (1)

式中，k为反应速率常数；C为时间t时的反应物浓度。

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费林试剂热滴定糖

姓名：周超

学号：201100140067

班级：11级生命基地

同组者：刘炳煜

时间：20##年5月21日

【实验目的】

1、初步掌握费林试剂热滴定定糖法的原理和方法。

2、正确掌握滴定管的使用方法和热滴定的终点。

【实验原理】

1. 还原糖

还原糖（reducing sugar ）：羰基碳（异头碳）没有参与形成糖苷键

能够还原斐林(H.von  Fehling)试剂或托伦斯(B.Tollens)试剂(银氨溶液)的糖称为还原糖，所有的单糖（除二羟丙酮和五碳糖，即核糖和脱氧核糖），不论醛糖、酮糖都是还原糖。大部分双糖也是还原糖，蔗糖例外。斐林试剂是含 Cu²⁺络合物的溶液，被还原后得到砖红色 Cu₂O的沉淀。托伦斯试剂被还原后（银镜反应）能生成单质银，在试管壁上可看到“银镜”。分子结构中含有还原性基团（如游离醛基`半缩醛羟基或游离羰基）的糖，叫还原糖。如葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖。 一般情况下，单糖的还原能力主要来自它的醛基，如葡萄糖，而多糖则大多因为半缩醛羟基的存在。还原后，自己会变成糖酸。如葡萄糖就会变成葡萄糖酸。

2. 菲林试剂

菲林试剂由氢氧化钠的质量分数为 0.1 g/mL 的溶液和硫酸铜的质量分数为 0.05 g/mL 的溶液，还有酒石酸钾钠配制而成的。它与可溶性的还原性糖(葡萄糖、果糖和麦芽糖)在加热的条件下，能够生成砖红色的氧化亚铜沉淀。因此，斐林试剂常用于鉴定可溶性的还原性糖的存在与否。

3. 实验方法

本实验采用费林试剂热滴定法，费林试剂是氧化剂，由甲、乙两种溶液组成。甲液含硫酸铜和次甲基蓝(氧化还原指示剂)；乙液含氢氧化钠，酒石酸钾钠和亚铁氰化钾。当甲、乙两溶液混合时，硫酸铜与氢氧化钠反应生成天蓝色的氢氧化铜沉淀。在碱性溶液中，酒石酸钾钠与沉淀的氢氧化铜作用形成可溶性的络合物。

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生物化学实验报告

费林试剂热滴定定糖法

 

一、实验目的

1. 学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 

2. 了解并掌握用组织块贴壁培养法和消化细胞培养法进行动物细胞原代培养的实验方法。 

3. 熟练掌握动物细胞传代培养的实验方法。

4. 学习细胞生死状态鉴别的方法。

5. 了解细胞生死状态鉴别的原理。 

6. 熟悉和掌握各种鉴别细胞生死状态方法的判定特征。 

7. 掌握细胞技术方法，计算细胞存活率

二、实验原理

还原糖是指含有自由醛基(如：葡萄糖)或酮基(如：果糖)的单糖和某些二糖(如：乳糖、麦芽糖)。在碱性溶液中，还原糖能将金属离子(Cu²⁺、Hg²⁺、Ag⁺等)还原，而糖本身被氧化成各种羟酸类化合物。该特性常用于糖的定性和定量测定。

实验采用费林试剂热滴定法，费林试剂是氧化剂，由甲、乙两种溶液组成。甲液含质量分数为0.05 g/mL的硫酸铜和次甲基蓝(氧化还原指示剂)；乙液含质量分数为0.1 g/mL的氢氧化钠，酒石酸钾钠和亚铁氰化钾。当甲、乙两溶液混合时，硫酸铜与氢氧化钠反应生成天蓝色的氢氧化铜沉淀。在碱性溶液中，酒石酸钾钠与沉淀的氢氧化铜作用形成可溶性的络合物，该含Cu2+络合物的溶液，被还原后得到砖红色Cu2O的沉淀。因此，斐林试剂常用于鉴定可溶性的还原性糖的存在与否。 

费林试剂热滴定定糖法的基本原理,是在沸热条件下,用还原糖溶液滴定一定量的费林试剂时, 将费林试剂中的铜离子还原为氧化亚铜, 以亚甲基蓝为指示剂, 稍过量的还原糖立即将蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的还原型亚甲基蓝, 指示滴定终点。

三、实验器材

1. 试剂

1.1费林试剂(定量)：

费林甲液：称取15克硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)和0.05克次甲基蓝，溶于1000毫升水中。

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高一生物 实验二 生物组织中还原糖、脂肪、蛋白质的鉴定

实验点拨

1、生物学中物质的鉴定与化学中物质的鉴定,其原理是一致的。化学中被鉴定的物质与所用的化学试剂要么发生颜色反应,要么产生沉淀, 在生物学中物质鉴定的理念是:某些化学试剂能够使生物组织中的有关有机化合物产生特定的颜色反应.

①可溶性还原糖+ 斐林试剂→砖红色沉淀.(水浴加热)
②脂肪小颗粒 + 苏丹Ⅲ染液→橘黄色小颗粒.(要显微镜观察)
③蛋白质 + 双缩脲试剂→紫色反应.(要先加A液NaOH 溶液再加B液CuSO4 溶液)

2、可溶性还原糖的鉴定实验中：应选择含糖量较高,颜色为白色或近白色的植物组织。

以苹果,梨为最好。且先要制备组织样液。研磨时，可加石英砂和水一起研磨。

3、斐林试剂要两液混合均匀且现配现用，切勿将甲液和乙液分别加入组织样液中。

斐林试剂的配制过程示意:

斐林试剂甲液　( 0.1 g/ml的 NaOH 溶液)

斐林试剂乙液　( 0.05 g/ml的 CuSO4 溶液)

4.关于鉴定还原糖的实验，在加热试管中的溶液时，应该用试管夹夹住试管上部，并放入盛开水的大烧杯中加热。注意试管底部不要接触烧杯底部，同时试管口不要朝向实验者，以免试管内溶液沸腾时冲出试管，造成烫伤。如果试管内溶液过于沸腾，可以上提试管夹，使试管底部离开大烧杯中的开水。
　　5.做鉴定还原糖的实验时，在鉴定之前，可以留出一部分样液，以便与鉴定后的样液的颜色变化作对比，这样可以增强说服力。

6、脂肪的鉴定实验中：实验材料应选择富含脂肪的种子,以花生种子为最好。实验前浸泡3h～4h（浸泡时间太短，不容易切片；浸泡时间过长，组织太软，切下来的薄片不易成形），最适宜切片。

7、实验中学生应分工合作。在“还原糖的鉴定”实验中，当每组两个学生中的一个制备生物组织样液时，另一个学生可以用酒精灯将水煮开，以便缩短实验的等待时间。在“脂肪的鉴定”实验中，一个学生制作临时装片时，另一个学生则可以调试显微镜。另外，在完成前两个实验时，一个学生洗刷试管、清洗玻片和整理显微镜，另一个学生则可以进行后一个实验的操作。

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T-DNA插入突变体的鉴定

同组者：

学号：

摘要  Ti质粒是上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。将感兴趣的基因改造插入到T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化，得到含有突变的植株。通过本实验，我们将学习如何用PCR的方法检测所得植株是否为T-DNA的插入突变体。

1.引言

T-DNA作为一种实验常用的遗传转化方法，在插入突变过程中，插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。

本次实验中，采用液CTAB（或者TSP法）提取拟南芥植株的DNA，然后PCR将所获DNA扩增，在之后采用琼脂糖凝胶电泳技术，分离处长度不一的DNA带，以确定样品是否为T-DNA插入突变纯和体。

PCR（Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。（PCR基本原理如右图）

DNA含有PO43-基团，在pH8.0 Buffer（本实验中为TAE）中带负电, 在电场中向正极移动。自由电泳时，由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，各核酸分子难以分开；选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的；同样条件对Marker电泳；起到鉴定的作用。不同浓度的琼脂糖凝胶对应线状DNA分子分离范围不同。（如下图）

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实验一  生物组中可溶性还原糖、脂肪、蛋白质的鉴定

一、教材分析：

    1．该实验是高中阶段生物课程的第一个实验。从此以后生物化学方面的内容增加。本实验的操作技能的学习为以后该类型实验打好基础，一定要强调规范化操作方法。

    2．低高倍镜的使用、徒手切片、临时装片等技能，学生经初三、高一两年的搁置，已显生疏。实验时教师可考虑予复习，或通过演示提醒学生，注意规范操作要领。

    3．本实验难度并不大，但由于内容较多、实验时间长，必须作周密安排才能完成。如实验中教师应做好学生的分工合作可缩短实验时间。同时又能培养学生的合作精神。

二、教学目标：

知识目标：阐明实验原理—颜色反应，识记和区分用于可溶性还原糖、脂肪、蛋白质鉴定的试剂及产生的特定颜色，初步掌握鉴定上述化合物的基本方法，学会描述实验现象，掌握NaOH溶液和CuSO4溶液的使用方法。

    能力目标：培养学生主动获取知识，应用知识分析现象，归纳总结的能力，培养学生实际操作的能力及从现象出发探求事物本质的能力。

    情感与价值目标：通过亲手实验体验科学家严谨治学的科学态度，培养实事求是的世界观。

三、教学重点：

    掌握鉴定生物组织中可溶性还原糖、脂肪、蛋白质的基本方法。

四、教学难点：

    实验内容较多，实验时间长，必须周密安排，才能按时完成。

    学生要分工合作、教师指导演示。

五、材料用具：

    实验材料：葡萄糖液、苹果组织液，植物油滴、浸泡过的花生种子或新鲜的花生种子，鸡蛋蛋白稀释液、黄豆组织液。

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