《培养基的制备与消毒灭菌》 实验报告

实验目的

1.学习和掌握配制培养基（以牛肉膏蛋白胨培养基的配制为例）的一般方法和原理。

2.了解消毒和灭菌的原理，掌握常用灭菌方法的操作步骤。

实验原理

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中．微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。不同微生物对PH要求不一样．雷菌和酵母的培养基的pH一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的pH一般为中性或微碱性的(嗜碱细菌和嗜酸细菌例外)。所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。此外，由于配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌．如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。

高压蒸气灭菌是将持灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀．继续加热，此时由于蒸气不能道出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂，琼脂在常用浓度下96℃时溶化，实际应用时，一般在沸水浴中或下而垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。

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一、实验题目：培养基的制备与灭菌

二、实验目的：

1、明确培养基的配置原则，掌握配置方法。

2、了解灭菌的原理，学习掌握灭菌器的使用方法。

三、实验器材：

1、药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、水、琼脂。

2、仪器：三角瓶、培养皿、试管、线绳、棉花、烧杯、报纸、移液管、试管架、铁针、量筒。

四、实验原理：

1、培养基的制备

包括一下几种成分：

（1）水分：主要成分。

（2）N源：包括无机氮和有机氮。

（3）C源：主要是含碳有机物、碳氢化合物等。

（4）无机盐：如NaCl、KH₂PO₄等。

         微量元素：Cu、K、Mg、S、P、Zn。

    有些还需要添加“生长因子”，通常是维生素类、某些氨基酸或核酸等。

2、培养基配置的原则

根据不同的培养对象及培养目的，选用不同的培养基，但有机物总量不得超过15%，盐类一般不超过1%。

培养基有以下分类：

按成分：天然培养基、合成培养基、半合成培养基

按状态：固体培养基、半固体培养基、液体培养基

按用途：基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基

培养基配好后应立即灭菌，防止营养物质中的微生物富集。

3、灭菌：

用理化手段杀灭一切微生物的营养体，包括芽孢和孢子，在实验中应对所有仪器、操作场所、药品及培养基灭菌或消毒。

（1）高压蒸汽灭菌：将物品放入封闭的加压灭菌器，加热使灭菌锅套间的水沸腾产生蒸汽，将冷空气排尽，压力上升，使水沸点变高，导致菌体蛋白质变性，一般0.1MPa、121℃、15~30min可以彻底灭菌，本次实验灭菌20min。若是含糖培养基，110℃、30min。

（2）干热灭菌：微生物细胞内蛋白质因高温而凝固变性。因高温，所以含水量小，不利于蛋白质受热变性，所以温度高，时间长。

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实验七 菌种保存

一、实验目的

为保持细菌原有的性状和活力，通过人为方法提供一定的条件，使细菌在低温、干燥、缺氧的环境中，生长受到抑制、新陈代谢处于最低范围内，生命活动基本处于休眠状态，从而达到保存菌种的目的。保存菌种的方法有很多，如斜面保存法、液体石蜡法、干燥保存法、液氮法、冷冻真空干燥法等。这里仅介绍斜面保存法。

二、讲解要点

1、斜面保存法 ，亦称传代培养保藏法，是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。

2、实验内容：无菌斜面制作、斜面接种；培养方法。

3、操作要点

1) 无菌操作要点

2) 斜面制作的基本操作手法

3) 火焰灼烧范围、避免烫伤菌体

4) 贴标、分区

5）接种要点

6) 培养要点

三、实验材料仪器

1. 细菌培养平板

2. 斜面培养基

3. 酒精灯、移菌环、无菌操作台、高压灭菌锅等。

四、实验步骤

1 培养基制备

1.1 器皿准备

培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。

1.2 溶解培养基配料

先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。

1.3 调pH值

配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%

氢氧化钠)调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。

1.4 加凝固剂

配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。

1.5 过滤分装

在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。

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培养基配制及灭菌实验报告单

班级 名字 小组成员 时间 指导老师

一、 实验目的

了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握高压蒸汽灭菌操作方法。

二、实验原理

培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。

马铃薯培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。

平板划线接种法（分离培养法）：是将细菌分离培养的常用技术，其目的是将混有多种细菌的培养物，或标本中不同的细菌（病原菌与非病原菌）使其分散生长，形成单个菌落或分离出单一菌株，便于识别鉴定。平板划线接种方法较多，其中以分段划线法与曲线划线法较为常用。

三、试剂与器材

1.器材

试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、镊子等。

2.试剂

马铃薯、葡萄糖、琼脂、水等

四、实验内容

1.称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查

2高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒压→降压回零→排气→取物→无菌检查

五、关键步骤及注意事

1.要严格按配方配制。

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       分离土壤中分解尿素的细菌和计数

                          制作：邹霖

1.实验目的：从土壤中分离出能够分解尿素的细菌，计数

2.实验原理：A.培养基中加入唯一氮源--尿素，能分解尿素的细菌自身能够合成脲酶，能够分解利用尿素中的氮元素，从而能够生存繁殖；不能分解尿素的细菌的繁殖受到抑制，从而达到分离出土壤中能分解尿素的细菌的作用。B.使用酚红鉴定尿素是否被分解.CO(NH2)2分解产生NH3使溶液显碱性.如果尿素被分解，则酚红会显红色，C.分解原理.

CO(NH2)2+H2O==脲酶==CO2+NH3 D.稀释涂布平板法. 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释浓度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养，在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。E.计数菌落，一个或几个细菌可以繁殖为一个肉眼可见的菌落（计数结果低于实际细菌数）

3.提出问题：尿素分解后NH3的产生是否会影响实验？

4.做出假设：尿素分解后NH3的产生会影响实验。

5.实验材料用具：超净工作台、取样铲、试管、锥形瓶、恒温培养箱、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、酒精灯、酒精、无菌水、地面以下3-8CM处的土壤、培养基A（磷酸二氢化钾 1.4g 磷酸氢化二钠 2.1g   七水合硫酸镁 0.2g  葡萄糖10g   尿素1g  琼脂 15g）培养基B（牛肉膏蛋白胨培养基） 涂布器、干热灭菌箱、烧杯、胶头滴管

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实验四  细菌的接种培养法与生长现象的观察

【目的和要求】

1．掌握无菌技术，建立无菌观念；明确无菌操作时注意要点。

2．掌握细菌的接种、分离培养方法和接种环的制作方法。

3．熟悉细菌生长现象的观察方法。

【试剂与器材】

1．菌种：葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌等。

2．培养基：固体、半固体、液体培养基。

3．其他：温箱、酒精灯、接种环、接种针、L形玻棒、打火机、记号笔等。

【实验内容】

一、细菌的接种工具

1．接种环和接种针：其结构包括环（针）、金属柄、绝缘柄三部分（见图4-1）。其中环（针）部分最佳材料为白金丝，因其受热和散热速度快，硬度适宜，不易生锈且经久耐用，但因为价格昂贵而限制了其应用。目前实验室常用的是经济实用的300~500W电热镍鉻丝。一般要求接种环长5~8cm，直径为2~4mm，定量接种环的容量为0.001ml。

图4-1  接种环和接种针

   接种环（针）在使用之前需检查镍鉻丝是否呈直线，若有弯曲，需用吸管或接种环的另一端将其压直；若环不圆，可将镍鉻丝前端放在吸管尖部缠绕一圈，再将镍鉻丝突出的部分朝内压紧。

   接种环用于固体、液体培养基的接种，接种针用于半固体培养基的接种。

2．L形玻棒：由直径2~3mm的玻璃棒弯曲成L形制成。在使用之前用厚纸包扎后置高压蒸汽灭菌，或沾取无水乙醇后在火焰上烧灼灭菌。主要用于液体标本涂布接种。

二、细菌的接种方法

1．液体培养基的接种 

该法主要用于细菌的增菌培养或进行细菌的生化反应。

方法：（图4-2）

（1）先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许细菌。

（2）左手拿试管，右手持接种环，用右手其余手指将试管塞打开，试管口通过火焰烧灼灭菌。

（3）将接种环在贴近液面的管壁上上下碾磨数次，使细菌均匀分布于培养基中。

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实验一：细菌、放线菌的形态

      观察与革兰氏染色

姓名:陈虹邑

学号：200911233012

系别：生物科学与生物技术

班级：周二第一组

试验日期：20##年9月13日

同组成员：邢悦婷  呼波

一、     实验目的及意义

1、巩固油镜的使用;

2、掌握细菌形态观察的基本方法；

3、了解细菌的基本形态和结构。

4、了解革兰氏染色的原理；

5、初步掌握细菌涂片的方法；

6、掌握革兰氏染色的方法；

7、掌握放线菌的涂片方法；

8、观察基内菌丝、气生菌丝和孢子丝。

二、     实验材料与方法

【实验材料】

菌种：溶血链球菌(Strptococcus haemolyticus),螺菌(Spirillum sp.) ,巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium), 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis), 普通变形菌(Proteus vulgaris), 丙酮丁酸梭菌(Clostridium acetotylicum), 褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)等细菌永久装片，放线菌5406，金黄色葡萄球菌（staphulococcus aureus），大肠杆菌（E. coli）

试剂：香柏油、无菌水、结晶紫、番红或沙黄、95%酒精、碘液

仪器及用具：显微镜、擦镜纸、吸水纸、小滴管，接种环、载玻片、盖玻片、酒精灯

【实验方法】

细菌的观察

1、在载玻片上滴一小滴水，用接种环，采用无菌操作，将细菌挑起，涂到载玻片上，盖上盖玻片。

2、用显微镜对细菌进行活体观察。观察时先用低倍镜，再用高倍镜，有必要的话，再用油镜观察。

3、观察细菌的永久装片，观察时先用低倍镜，再用高倍镜，有必要的话，再用油镜观察，找到细菌的各种结构。

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