蛋白质测定方法

——化学报告

蛋白质的检测

              

     由上表可大致了解五种检测蛋白质的方法，下面以实验的形式进行详细阐述：

1　材料与方法

1.1　仪器材料

(1)仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、抽滤泵。

(2)试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、0.12mol/LpH=4. 7醋酸- 醋酸钠缓冲液、乙醇-乙醚等体积混合液、浓H2SO4 、40%氢氧化钠、30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0. 050molPL标准盐酸溶液、硫酸钾- 硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、双缩脲试剂、考马斯亮蓝G- 250试剂。

1.2　实验方法

(1)凯氏定氮法测定蛋白质含量

将待测样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨(消化) ,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。为了加速消化,可以加入CuSO4 作催化剂和加入K2SO4 以提高溶液的沸点,而加入30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用标准盐酸溶液进行滴定,记录,计算出样品含氮量。每个样品做三次重复测定,取平均值。

(2)紫外吸收法测定蛋白质含量

蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。

紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如,

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实验一 双缩脲法测定血清蛋白质含量

【实验名称】：双缩脲法测定血清蛋白质含量

室温：20°

（一）实验目的： 1.掌握双缩脲法测定蛋白质的原理。2.学习掌握分光光度计的使用。

3.掌握标准曲线的制作。4.学习分光光度法测定的原理和方法。

（二）实验原理：血清中蛋白质的肽键（-CO-NH-）在碱性溶液中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物。此反应和两个尿素分子缩合后生成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2）在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称之为双缩脲反应。这种紫红色络合物在540nm处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈正比关系，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得蛋白质含量。

（三）实验材料与仪器：

1.仪器和材料： 分光光度计、7支试管、1毫升刻度吸管3支、移液器、坐标纸。

2.试剂：6mol/L的NaOH、双缩脲试剂、9g/L的NaCl溶液、蛋白质标准液（10g/L)、待测血清样本。

（四）实验步骤和结论:

1.取7支试管，编号，按照图1操作并记录。

表 1

2.在坐标纸上以各管蛋白质含量为横坐标，光吸收值（两管平均值）为纵坐标，绘制标准曲线。

表2

3、由标准曲线查出待测的血清样本的蛋白质浓度，由表1得出测定管的蛋白质的λ光吸收值为0.317，由表2得出测定管的蛋白质的浓度为1.4g/L

4、按照光吸收法计算公式计算，从标准管中选一管与测定管光吸收值接近者，按公式

C标A测C测?A标

计算待测血清样本的蛋白质浓度，从上可选A测 = 0.317

C标=0.354 ,A标=1.6 g/L; 则得到：C测=1.432 g/L

【注意事项】 ： 1.本实验是定量实验，要求所有玻璃仪器必须清洁，整齐、干燥。蛋白质标准液和血清取量必须准确。

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实验报告：检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质

班级：       学号：       姓名：             

一、 实验原理：
1. 某些化学试剂能使生物组织中得有关化合物产生特定的            反应。
2. 糖类中的还原糖，如         、          与           发生作用，生成          。
3. 脂肪可以被               染成橘黄色，或被               染成红色。
4. 蛋白质与               发生作用，产生      反应。   
二、 材料用具：
 实验材料：                                              。
 用具：双面刀片，试管，试管夹，大小烧杯，小量筒，三脚架，石棉网，火柴，载玻片，盖玻片，毛笔，吸水纸，显微镜等。
 试剂：斐林试剂，甲液：质量浓度为                 ，乙液：质量浓度为                 ；苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ染液，双缩脲试剂：A液：质量浓度为              ，B液质量浓度为                。
三、    方法步骤：
（一）    还原糖的检测和观察
①向试管内注入2ml                         。（选择具体材料）
②向试管内注入          斐林试剂，（甲液和乙液                 再注入。）
③将试管放入盛有                  的大烧杯中加热   。
④观察试管中出现的颜色变化。
（二）    脂肪的检测和观察

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生物化学实验报告

姓    名：         

学    号：     

专业年级：         

组    别：        

生物化学与分子生物学实验教学中心

一、实验目的

1、掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作；

2、熟悉血清总蛋白的临床意义；

3、了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。

二、实验原理

（一）：双缩脲反应

在碱性溶液中,双缩脲(H2NOC－NH－CONH2)能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物,这个反应叫做双缩脲反应。两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应 ，生成紫红色络合物；蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。

三、材料与方法：

实验材料

样品：大牛血清

试剂：双缩脲试剂、蛋白质标准液（70g/L）、生理盐水（0.9%）

器材：试管、加样枪、刻度吸管、洗耳球

设备：1100分光光度计、水浴锅

实验步骤

取3支试管，做好标记(B空白对照，S标准液，U为待测大牛血清)，按下表操作：

a.各管混匀，观察各试管颜色

b.将各试管置于37℃水浴锅中加热20min，观察颜色

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实验一蛋白质的含量测定-双缩脲法

一．       实验目的：掌握双缩脲法测定蛋白浓度的原理及方法。

二．实验原理

1. 双缩脲反应:

在碱性溶液中，双缩脲(H₂N-OC-NH-CO-NH₂)与CuSO₄作用形成紫红色的络合物，在540nm处有最大吸收，这一反应称为“双缩脲反应”。凡具有两个或两个以上的肽键(-CO-NH-)的化合物都呈双缩脲反应。蛋白质分子中因含有很多的肽键，故所有蛋白质都有双缩脲反应。在一定的浓度范围内，生成的颜色深浅与蛋白质含量成正比，因此可用作蛋白质定量测定。

由于参与反应的是蛋白质的肽链结构，与组成蛋白质分子肽链氨基酸残基的侧链功能关系较少。因此，不同蛋白质的双缩脲反应基本相似。

2. 分类:

常量法：测定蛋白质浓度范围：1∽10mg/ml,选用540nm比色测定。

微量法：选在310∽330nm检测，灵敏度比540nm检测高10倍。

优点: ①利用双缩脲反应生成有色物质用作蛋白质的比色测定受蛋白质种类影响较小, 是优点之一。

②试剂和操作的简单、迅速也是其优点。

缺点: 灵敏度较差，仅适用于蛋白质浓度在0 .5mg/ml以上的样品测定 。Tris缓冲液、类脂、色素、一些氨基酸等会干扰此测定。

3. 本实验原理:

本实验选用面粉作为测试样品，测定面粉中的蛋白质含量。

三．试剂和器材

1．测试样品：面粉。

2．试剂：

①  标准蛋白质溶液：10mg/mL牛血淸白蛋白（BSA）溶液。

②  常量法的双缩脲试剂。

③  0.05mol/L NaOH溶液。

3．器材：分光光度计，电子分析天平，移液管(10 mL×2)，离心机。

。

四．实验操作

1.标准曲线的绘制：

①取6 支试管，按下表操作：

②用Excel 绘制标准曲线及计算公式，如图：

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实验八  双缩脲法测定面粉中蛋白质的含量

一、目的要求

1．学习双缩脲法的基本原理及操作。

2．通过实验学会制作标准曲线。

二、实验原理：

双缩脲（NH₃CONHCONH₃）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO₄形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。在一定的浓度范围内，紫色络合物颜色深浅与蛋白质含量呈线性关系（即：颜色的深浅与蛋白质浓度成正比）而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可在540nm处比色用来测定蛋白质含量。测定范围为1－10mg蛋白质/ml。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

    此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

三、操作方法：

1．标准曲线的制作。酪蛋白：10mg/ml（如果用干酪素来配制则需用0.05M NaOH做溶剂，也可以用酪蛋白酸水解物直接配制。）

计算出各管浓度（计算出各管浓度，再做标准曲线，那么最后计算的公式中就不用除以6了，这么做好理解些。）

混匀，放置30分钟后，在540nm处以1号管调0点，测定各管吸光度，以吸光度（OD值）为纵坐标，蛋白质浓度（酪蛋白的毫克数）为横坐标绘制标准曲线。

四、样品处理

1．0.25g小麦面粉＋0.5ml四氯化碳＋25ml双缩脲试剂（四氯化碳为有机溶剂，在这里作为分散剂，使面粉不成团。）；

2．加塞，在摇床上振摇30分钟，使之充分混匀、反应，然后于实验台上静置10分钟；

3．离心，4000rPm，离心15分钟；

4．取上清比色：OD 540 nm；（在用滴管取上清时要轻、缓，避免沉淀物上浮。对照管是以介质溶液调零，即去除样品后的溶剂，在这里为0.5ml四氯化碳＋25ml双缩脲试剂。）

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实验一:双缩脲法测定蛋白质含量

一  目的  掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理及方法。

二  原理

双缩脲(                           )是两分子尿素经180℃左右加热,放出一分子氨( NH3)后得到的产物。在强碱溶液中，双缩脲与CUSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。其原因是含有两个及以上肽键或类似肽键有化合物都具有类似双缩脲反应。蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与CU2+络合成紫红色的络合物。其颜色的深浅与被测样品中蛋白质浓度呈正比，而与蛋白质分子量和氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。该法对样品中蛋白质含量要求相对较高，一般在1—10mg/L蛋白质。tris（三甲羟基氨基甲烷）、一些氨基酸、EDTA（乙二胺四乙酸）、草二酰胺、多肽等会于扰该测定。

在一定浓度范围内，反应后颜色与被测样品蛋白质含量呈线性关系，即蛋白质浓度越高，体系的颜色越深。反应产物在540nm处有最大吸收峰（吸光度）。

   将未知浓度的样品溶液与一系列已知浓度的标准蛋白质溶液同时与双缩脲试剂反应，并在540nm处比色，可通过标准浓度蛋白质绘制的标准曲线，求得未知样品中的蛋白质含量（浓度）。

   由于本法操作简便、迅速、蛋白质浓度与光密度的线性关系好，故对蛋白质快速而不需要十分精确的测定可用此法。

三  仪器与器材

可见光分光光度计、水浴锅、分析天平、振荡机（器）、漏斗、试管架、具塞三角瓶（100ml）

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