实验七、血清胆固醇的定量测定（磷硫铁法）

实验目的：

掌握磷硫铁法测定血清胆固醇的原理、方法及临床意义。

实验原理：

总胆固醇的测定有化学比色法(磷硫铁法和邻苯二甲醛法)和酶学方法(试剂盒)两类。本实验采用磷硫铁法测定血清胆固醇含量。

用无水乙醇提取血清中的胆固醇，再与硫磷铁试剂作用，产生颜色反应，呈色度与胆固醇含量成正比，可用比色法测定血清中胆固醇含量。

血清经无水乙醇处理，蛋白质被沉淀，胆固醇及其酯溶解在无水乙醇。在乙醇提取液中，加磷硫铁试剂，胆固醇及其酯与试剂形成比较稳定的紫红色化合物，此物质在560nm波长处有特征吸收峰，可用比色法作胆固醇的定量测定。正常血清中胆固醇的含量有随年龄增大而增加的趋势，其平均正常值在110～220mg/100ml。

胆固醇含量在400mg/100ml内，与A（或OD）值呈良好线性关系。

实验讲授：

722型分光光度计的使用

    测量原理
    分光光度法测量的理论依据是伯郎—比耳定律：当容液中的物质在光的照射和激发下，产生了对光吸收的效应。但物质对光的吸收是有选择性的，各种不同的物质都有其各自的吸收光谱。所以根据定律当一束单色光通过一定浓度范围的稀有色溶液时，溶液对光的吸收程度A与溶液的浓度c（g/l）或液层厚度b (cm) 成正比。其定律表达式A = abc（a是比例系数）。当c的单位为mol/l时，A = εbc，比例系数用ε表示，称为摩尔吸光系数。其单位为L·mol-1·cm-1，它是有色物质在一定波长下的特征常数。
    T (透光率) = I/I₀ A (吸光度) = -lgT 或 A = K·C·L (比色皿的厚度)
    测定时，入射光I, 吸光系数和溶液的光径长度不变时，透过光是根据溶液的浓度而变化的，即“K”为常数。比色皿厚度一定，“L”、“I₀”也一定。只要测出A即可算出“C”。《分光光度计的表头上，一行是透光率，一行是吸光度。》

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实验三  血清总胆固醇的测定

目的要求

    了解并掌握胆固醇测定的原理和方法。

实验原理

    血清胆固醇(chol)测定是动脉粥样硬化性疾病防治、临床诊断和营养研究的重要指标。正常人血清胆固醇含量范围为100 ~ 250mg/mL。

胆固醇是环戊烷多氢菲的衍生物，它不仅参与血浆蛋白的组成，而且也是细胞的必要结构成分，还可以转化成胆汁酸盐、肾上腺皮质激素和维生素D等。胆固醇在体内以游离胆固醇及胆固醇酯两种形式存在，统称总胆固醇。总胆固醇的测定有化学比色法和酶学方法两类。本实验采用前一种方法。

    胆固醇及其酯在硫酸作用下与邻苯二甲醛产生紫红色物质，此物质在550nm波长处有最大吸收。因此，可用比色法作总胆固醇的定量测定。胆固醇含量在400mg/100mL以内时，与光吸收值呈良好线性关系。

本法不必离心，颜色产物也比较稳定。

试剂和器材

一、试剂

邻苯二甲醛试剂：称取邻苯二甲醛50mg，以无水乙醇溶至50mL冷藏，有效期为一个半月。

混合酸：冰乙酸100mL与浓硫酸100mL混合。

标准胆固醇贮存液（1mg/mL）：准确称取胆固醇100mg，溶于冰乙酸中，定溶至100mL。

标准胆固醇工作液（0.1mg/mL）：将上述贮存液以冰乙酸稀释10倍，即取10mL用冰

乙酸稀释至100mL。

二、测试样品

0.1mL人血清以冰乙酸稀释至4.00mL。

三、器材

试管1.5×15cm（×11）；移液枪，量筒50mL分光光度计。

操作方法

    一、制作标准曲线

取9支试管编号后，按下表顺序加入试剂：

加毕，温和混匀，20～37℃下静置10分钟，在550nm波长处测定光吸收值。以总胆固醇量（mg%）为横坐标，光吸收值为纵坐标做出标准曲线。

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血清胆固醇的定量测定

（磷硫铁法）

实验目的

掌握磷硫铁法测定血清胆固醇的原理和方法。

实验原理

（一）胆固醇的生理功能：

–参与血浆蛋白的组成；

–细胞膜的结构成分；

–胆汁酸盐、肾上腺皮质激素和维生素D等的前体。

(二)测定原理：

总胆固醇的测定有化学比色法(磷硫铁法和邻苯二甲醛法)和酶学方法(试剂盒)两类。本实验采用磷硫铁法测定血清胆固醇含量。

血清经无水乙醇处理，蛋白质被沉淀，胆固醇及其酯溶解在无水乙醇。在乙醇提取液中，加磷硫铁试剂，胆固醇及其酯与试剂形成比较稳定的紫红色化合物，此物质在560nm波长处有特征吸收峰，可用比色法作胆固醇的定量测定。正常血清中胆固醇的含量有随年龄增大而增加的趋势，其平均正常值在110～220mg/100ml。

胆固醇含量在400mg/100ml内，与A（或OD）值呈良好线性关系。

试剂

（一）10％三氯化铁溶液：10gFeCl3.6H2O(A.R)溶于磷酸(A.R)，定容至100ml。储于棕色瓶，冷藏。

（二）磷硫铁试剂：取10％FeCl3溶液1.5ml于100ml棕色容量瓶内，加浓硫酸 (A.R)至刻度。

（三）胆固醇标准储液：准确称取胆固醇80mg，溶于无水乙醇，定容至100ml。

（四）胆固醇标准溶液：将储液用无水乙醇准确稀释10倍即得。每毫升含0.08mg胆固醇。

操作

（一）吸取血清0.1ml于干燥离心管，先加无水乙醇0.4ml，摇匀后再加无水乙醇2.0ml，摇匀，10分钟后离心（3000rpm5分钟），上清夜备用。（分两次加入乙醇的目的是使作用完全）

（二）取干燥试管3支，编号，分别加入 无水乙醇1.0ml（空白管）、胆固醇标准溶液1.0ml（标准管）、上述乙醇提取液1.0ml（样品管），各管皆加入磷硫铁试剂1.0ml，摇匀，10分钟后，分别转移至0.50cm光径的比色杯内，用分光光度计560nm比色。 计算

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实验七 胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇

实验八 二乙酰一肟法测定血清尿素

课程名称：生物化学与分子生物学实验课 年级：2005 专业、层次：临床、营养与食品、口腔本科 授课教师：符伟玉 职称：讲师 基本教材：自编 《生物化学与分子生物学实验指导》

教学目的与要求：

1、掌握酶法测定总胆固醇的原理和方法。 2、学习用比色法测定血清尿素。 3、巩固有关胆固醇和尿素的知识。

4、进一步熟练UV2100型分光光度计的使用。

大体内容与时间安排：

1、氧化酶法测定总胆固醇的原理 2、氧化酶法测定总胆固醇的注意事项 3、二乙酰一肟法测定血清尿素的原理 3、二乙酰一肟法测定血清尿素的注意事项 4、学生做实验

教学方法：讲授式+启发式

教学重点、难点：

重点：1、氧化酶法测定总胆固醇的原理

2、二乙酰一肟法测定血清尿素的注意事项 难点：氧化酶法测定总胆固醇的原理

学时：4学时 5min 5min 5min 5min 140min

一、实验原理

（一）氧化酶法测定血清总胆固醇

血清总胆固醇(TC)包括：游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)两部分。本实验是

胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化物酶相偶联发生的偶联反应。

第一步：血清胆固醇酯可被胆固醇酯酶水解为游离胆固醇和游离脂肪酸

(FFA) 。

第二步：胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成△4-胆甾烯酮和H2O2。

第三步：H2O2在4-氨基安替比林和酚存在时，经过氧化物酶催化，反应生

成苯醌亚胺非那腙的红色醌类化合物，其颜色深浅与标本中TC含 量成正比。

（二）二乙酰一肟法测定血清尿素

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脂肪酸酸价测定与血清胆固醇的测定

一、实验目的

1.了解脂肪酸价测定的原理和方法；

2.了解并掌握胆固醇测定的醋酸酐法。

二、实验原理

A、  天然油脂长期暴露在空气中会发生臭味，这种现象称为酸败。酸败是由于油脂水解释放出的游离脂肪酸，在空气中被氧化成醛或酮，从而有一定的臭味。酸败的程度用酸价来表示。酸价是中和1g油脂的游离脂肪酸所需KOH的毫克数。

         油脂中的游离脂肪酸与KOH发生中和反应，从KOH标准溶液消耗量可计算出游离脂肪酸的量。反应式如下：

         RCOOH + KOH               RCOOK + H₂O

B、  血清意胆固醇测定对高脂血症的诊断、冠心病和动脉粥样硬化和防治均有意义。血清总胆固醇升高常见原发性高胆固醇血症、肾病综合症、甲状腺机能减退、糖尿病等疾病。

胆固醇的测定临床常用的比色法有两类：

1、固醇化的氯仿式醋酸溶液中加入醋酸酐-硫酸试剂，产生蓝绿色。

2、固醇的醋酸、乙醇式异丙醇溶液中加入高铁-硫酸试剂产生紫红色。

         由于胆固醇颜色反应特异性差，直接测定往往受血液中其倔因素干扰，所以精细的方法是先经抽提，分离及纯化等步骤，然后显色定量。

         本实验采用醋酐-硫酸单一试剂显色法。本法测定100ml血清总胆固醇的正常值为125~200mg。

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生物化学与分子生物学设计实验 （胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇及二乙酰一肟

法测定血清尿素）

小组成员：

班级：麻醉11-2班

日期：20xx年12月19

胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇及二乙酰一肟法

测定血清尿素

实验目的

1、掌握酶法测定总胆固醇的原理和方法。

2、学习用比色法测定血清尿素。

3、巩固有关胆固醇和尿素的知识。

4、进一步熟练UV2100型分光光度计的

重点、难点：

重点：1、氧化酶法测定总胆固醇的原理

2、二乙酰一肟法测定血清尿素的注意事项

难点：氧化酶法测定总胆固醇的原理

一、实验原理

（一）氧化酶法测定血清总胆固醇

血清总胆固醇(TC)包括：游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)两部分。本实验是

胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化物酶相偶联发生的偶联反应。

第一步：血清胆固醇酯可被胆固醇酯酶水解为游离胆固醇和游离脂肪酸

(FFA) 。

第二步：胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成△4-胆甾烯酮和H2O2。

第三步：H2O2在4-氨基安替比林和酚存在时，经过氧化物酶催化，反应生

成苯醌亚胺非那腙的红色醌类化合物，其颜色深浅与标本中TC含 量成正比。

（二）二乙酰一肟法测定血清尿素

二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜

色深浅与尿素含量成正比。因二乙酰不稳定，故由试剂中二乙酰一肟与强酸作用

产生二乙酰。

二、操作步骤

（一）氧化酶法测定血清总胆固醇

2

终点法检测TC，取试管3支按下表依次加样。

酶法测定TC操作步骤

加入物(μl) 血清 标准液或定值血清

蒸馏水 酶试剂

空白管 － － 20 1 000

标准管 － 20 － 1 000

测定管 20 － － 1 000

混匀后，37℃保温10 min，每管加3ml水混匀，用分光光度计比色，于500 nm波长处以空白管调零，读出各管吸光度。

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第__5__次课                             授课时间：20##年11月29日～11月30日

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