血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳

原理：

将血清脂蛋白用脂类染料(如苏丹黑或油红O等)进行预染.再将预染过的血清置于琼脂糖凝胶板上进行电泳分离.通电后,脂蛋白向正极移动,并分离为几个区带.

试剂与器材：

1、巴比缓冲液(pH8.6,离子强度0.075)：为电极缓冲液

巴比妥钠15.4g,巴比妥2.76g,EDTA酸0.292g,加水溶解后加水至1000ml

2、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.6)为凝胶缓冲液

三甲基氨基甲烷1.212g,EDTA酸0.29g,NaCl 15.85g加水溶解后加水至1000ml

3、琼脂糖凝胶

琼脂糖0.45g,三痉甲基氨基甲烷缓冲液50ml,水50ml

加热至沸,待琼脂糖溶解后立即停止加热.

4、挖槽工具制作

切口刀：刀口长15mm的刀片,中央夹一有机玻璃或木片,用螺丝固定,使两刀片相距1.5mm.挖槽小匙：用直径1.5mm的铜丝约6cm长,一端锤成扁平,用砂纸磨光.

5、电泳槽和电泳仪：同血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的仪器.

操作：

1、预染血清：血清0.2ml加苏丹黑染色液0.2ml于小试管中,混合后置37℃水浴染色30分钟,然后离心(2000转/分,约5分钟).

2、制备琼脂糖凝胶板：将已配制的0.45%琼脂糖凝胶于沸水浴中加热融化,用吸管吸取凝胶溶液浇注载玻片,每片2.5ml,静置约半小时后凝固(天热时需延长,可放冰箱数分钟加速凝固).

3、点加血清：已凝固的琼脂糖凝胶板的一端约2cm处,用切口刀片垂直切入凝胶后立即取出,然后用铜丝小匙将长方小条凝胶取出.以小片滤纸吸干小槽中水分,用血色素吸管吸取经过预染的血清约15μl,注入凝胶板上的小槽内.

4、电泳：将加过血清的凝胶板平行放入电泳槽中,样品应在阴极一端.两块三层纱布于巴比妥缓冲液中浸润,然后轻轻紧密贴在凝胶板两端,纱布的另一端浸于电 泳槽内的巴比妥缓冲液(注意：此电极缓冲液不能用三羟甲烷缓冲液代替).接通电源,电压为120~130V,每片电流为3~4mA.约经电泳15至55分 钟,即可见分离之色带.

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【原理】

琼脂糖（agarose）是经过挑选，以质地较纯的琼脂（agar）作为原料而制成的。琼脂在化学上是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物。琼脂胶是一含有硫酸根和羟基的多糖，它具有离子交换性质，这种性质会给电泳及凝胶过滤以不良的影响。琼脂糖是直链多糖，它由D－半乳糖和3,6－脱水－L－半乳糖的残基交替排列组成。

琼脂糖主要通过氢键而形成凝胶。电泳时因凝胶含水量大（98－99%），近似自由电泳，因为固体支持物的影响少，故电泳速度快，区带整齐。而且由于琼脂糖不含带电荷的基团，电渗影响很少，是一种较好的电泳材料，分离效果较好。

血清中脂类物质与血清载脂蛋白结合成水溶性的脂蛋白（lipoprotein）形式存在。各种脂蛋白中所含载脂蛋白的种类及数量不同，各种脂蛋白颗粒大小也相差很大，因此，以琼脂糖凝胶为支持物，在电场中可使各种脂蛋白颗粒分离开来。

琼脂糖凝胶电泳分离血清蛋白方法简单。将血清脂蛋白用脂类染料苏丹黑（或油红等）进行预染。再将预染过的血清加样于琼脂糖凝胶板加样槽中，通电后可以看到脂蛋白向正极移动，并分离出几个区带。

正常人血清脂蛋白可出现三条区带，从阴极到阳极依次为β－脂蛋白（最深），前β－脂蛋白（最浅）及α－脂蛋白（比前β－脂蛋白略深些），在原点处应无乳糜微粒。有时前β－脂蛋白也显示不出来。

琼脂糖主要通过氢键而形成凝胶。电泳时因凝胶含水量大（98－99%），近似自由电泳，因为固体支持物的影响少，故电泳速度快，区带整齐。而且由于琼脂糖不含带电荷的基团，电渗影响很少，是一种较好的电泳材料，分离效果较好。

血清中脂类物质与血清载脂蛋白结合成水溶性的脂蛋白（lipoprotein）形式存在。各种脂蛋白中所含载脂蛋白的种类及数量不同，各种脂蛋白颗粒大小也相差很大，因此，以琼脂糖凝胶为支持物，在电场中可使各种脂蛋白颗粒分离开来。

琼脂糖凝胶电泳分离血清蛋白方法简单。将血清脂蛋白用脂类染料苏丹黑（或油红等）进行预染。再将预染过的血清加样于琼脂糖凝胶板加样槽中，通电后可以看到脂蛋白向正极移动，并分离出几个区带。

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琼脂糖凝胶电泳法分离预染血清脂蛋白

【目的】

1. 掌握琼脂糖凝胶电泳法分离预染血清脂蛋白的实验原理和操作方法。

2. 熟悉血清脂蛋白改变在临床上的重要意义。

【原理】

电泳是指带电颗粒在电场的作用下，向着与其自身所带电荷相反的电极移动的现象。根据电泳支持物的不同，血清脂蛋白电泳可分为滤纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳四类。由于各种脂蛋白所含载脂蛋白和脂类的种类及数量不同，分子量大小相差较大，并且在一定 pH 值溶液中所带电荷量不同，电泳移动的速度必然有差别，因此，通过电泳可以将不同种类的血清脂蛋白彼此分离。

血清脂蛋白经苏丹黑 B 预染后，以琼脂糖为载体，在 pH 8.6 巴比妥缓冲液中进行电泳，可将脂蛋白分成不同的区带（图 3-9 ）。正常人空腹状态下，血清脂蛋白电泳后可出现三条区带，从阳极到阴极依次为 α- 脂蛋白带、前 β- 脂蛋白带及 β- 脂蛋白带。点样槽处不会出现乳糜微粒，有时前 β- 脂蛋白也显示不出来。区带的宽窄及颜色的深浅粗略地反应了各种脂蛋白的量。

另外，可以将已烘干的凝胶片直接放到吸光度扫描仪上，通过扫描得出各种脂蛋白的百分比含量。或者，将电泳后凝胶板上各区带切下，比色定量分析出各种脂蛋白的百分比含量。

图 3-9 预染血清脂蛋白电泳图谱

【器材】

1 ．电泳仪

2 ．恒温水浴箱

3 ．离心机

4 ．微量加样器

5 ．烫槽器

6 ．载玻片

7 ．扫描仪

8 ．分光光度计

9 ．小号试管

10 ．吸管

11 ．纱布

12 ．烘箱

【试剂】

1 ．电泳缓冲液（ pH8.6 ，离子强度 0.075 的巴比妥缓冲液）

称取巴比妥钠 15.458g ，巴比妥 2.768g ，乙二胺四乙酸（ EDTA ） 0.29g ，加适量蒸馏水溶解后加至 1000ml 。

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1．实验目的：

（1）通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒；

（2）通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术；

2．实验材料及用品

（1）实验仪器（apparatus）：

恒温培养箱（Constant temperature incubator）、恒温摇床（Constant temperature shaking table）、高速离心机（High speed centrifuge）、漩涡振荡器（Vortex mixer）、超净工作台（Bechtop）、高压灭菌锅（Autoclave）、微量加样器（Pipettes）、烧杯（ beaker）、量筒 （graduated cylinder）、 玻璃棒（stir bar）、 微波炉（microwave）、 天平（Pan balance）、电泳梳子（ comb）、电泳槽 （electrophoresis tank）、 电泳器 （Electro-phoresis  System）、 紫外灯（Ultraviolet  transilluminator ）

3）、材料与试剂（Reagents）：

①溶液I（Solution Ⅰ）：

50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L  三羟基甲基氨基甲烷（Tris）Tris-HCl（pH8.0）；10mmol/L  乙二胺四乙酸（EDTA） pH8.0

溶液I可成批配制，每瓶约100ml，10磅高压蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。

②溶液Ⅱ（Solution Ⅱ）：新鲜配制，等体积混合

0.2mol/L  NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）；1%  SDS （可用10％贮存液稀释配制）注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。

③溶液III （Solution Ⅲ，100mL)：加上后混匀会形成絮状沉淀

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一、实验名称：质粒DNA的提取与纯化，DNA琼脂糖凝胶电泳

二、实验原理：

1.质粒DNA的提取：

质粒是一类存在于几乎所有细菌等微生物中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的DNA分子，能够自主复制和稳定遗传，以超螺旋形式存在，是最常用的基因克隆载体。除质粒外，大肠杆菌中还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂质等物质，因此需要裂解细胞并除去蛋白质和染色体DNA等物质才能分离纯化出质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验使用碱裂解法，即利用SolutionⅠ 、Ⅱ、Ⅲ三种溶液分离提取质粒DNA.其原理如下。

（1）碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理：

碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA之间变性与复性的差异来分离质粒DNA，达到分离提纯质粒DNA的目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，线性的DNA因氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的大部分氢键会被断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链相互缠绕，不会完全分离。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性，恢复其天然构象，以可溶状态存在于液相中；而线性的染色体DNA由于两条互补链彼此已完全分开、分子量大、结构复杂而相互缠绕形成不溶性网状结构。与不稳定的大分子RNA、变形的蛋白质以及细菌碎片等一起沉淀而被除去。进一步用酚、氯仿使蛋白质变性去除蛋白质杂质，然后用无水乙醇沉淀，即可获得纯化的质粒DNA。SolutionⅠ 、Ⅱ、Ⅲ三种溶液以及无水乙醇沉淀DNA的具体作用和原理如下。

（2）四种溶液作用及原理：

①Solution I的作用：悬浮大肠杆菌菌体，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉，从而起到抑制DNA酶对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。另外也可保证溶菌酶活性。

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实验三聚合酶链式反应（PCR）以及琼脂糖凝胶电泳

实验目的

1.掌握PCR反应的原理及各反应成分的作用；

2.熟悉PCR反应程序的设计规则；

3.掌握引物的设计原则及其与PCR其他成分的配制方法；

4.掌握琼脂糖凝胶电泳的原理及其应用范围；

5.熟悉琼脂糖凝胶电泳相关缓冲液的配制方法。

实验原理

一．聚合酶链式反应原理

在已知待扩增模板全部或部分序列的情况下，依据DNA半保留复制的机理，在含有Mg2+的缓冲溶液中，采用耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在特异性引物（分为上游和下游引物）的引导下，通过dNTP为原料，以cDNA或DNA等为模板，在人为控制DNA合成系统（PCR仪）温度调节下，通过变性（95℃）、退火（50-60℃ ）及延伸（ 72℃ ）等3个步骤的循环进行（30-35循环），在体外进行双链DNA变性为单链，单链DNA与特异性引物退火形成局部双链，进而在DNA聚合酶的作用下使引物沿相应模板延伸为特异性引物所限定范围的大量双链DNA的体外合成反应。

本质为体外DNA合成的酶反应。

二．琼脂糖凝胶电泳反应原理

    琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。在一定电场强度下偏碱性的缓冲液中（TAE pH8.0或TBE pH7.5-7.8），DNA分子带负电，其迁移速度取决于分子筛效应，在电荷效应与分子筛效应作用下，具有不同的相对分子量及构型的DNA片段泳动速度不同。DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。

    凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可以分离分子量相同，但构型不同的DNA分子。如质粒的三种构型的泳动速率不同：超螺旋闭合环状质粒最快，线型质粒其次，开环质粒最慢。

实验步骤

（一）PCR 加样术式 

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