一、实验目的

1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。

2、学习并掌握细胞传代培养的方法。

3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。

二、实验原理

细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。

动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。

动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。

原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。

传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。

    高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。

三、细胞培养相关设施及材料

1、细胞培养室

无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。

孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO₂。

制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。

储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。

…… …… 余下全文

二．实验报告

…… …… 余下全文

姓名董朔晖  系年级生命科学院2011级  学号201100230164

科目细胞生物学实验  实验题目动物细胞融合 日期 2012.03.01

实验二：动物细胞融合

一、实验目的

1、了解动物细胞融合的常用方法。

2、学习化学融合的基本操作过程。

3、观察动物细胞融和过程中细胞的行为和变化。

二、实验用品

1、材料

鸡血红细胞

2、试剂

50%PEG、Hank’s溶液（pH7.4）、Alsever’s细胞保存液0.85%氯化钠溶液。

3、器材

普通光学显微镜、离心机、量筒、载玻片、盖玻片离心管、废液缸等。

三、实验原理

细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括病毒诱导融合、化学诱导融和和电激诱导融合。

1、病毒诱导融和

仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融时也可介导细胞与细胞的融合。用紫外线灭活后，这些病毒即可

姓名董朔晖   系年级生命科学院20##级   学号201100230164

科目细胞生物学实验   实验题目动物细胞融合  日期2012.03.01

诱导细胞发生融合。

2、化学诱导融合

很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中想接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。PEG是广泛使用的化学融合剂。

…… …… 余下全文

实验七 动物组织中核酸的提取和鉴定

【原 理】

动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖孩酸(DNA)大部分与蛋白质结合形成核蛋白。核蛋白可被三氯醋酸沉淀，再用95％乙醇加热可以除去附着在沉淀上的脂类杂质，然后用10％NaCl溶液提取出核酸的钠盐，加入醇可使核酸钠沉淀析出。

先用水由动物肝中提出核蛋白，再籍酚将核酸与蛋白质之间的结合键断裂，并用乙醚抽提去蛋白质及其它杂质，最后用乙醇将核酸沉淀。

核酸(RNA、DNA)可被硫酸水解产生磷酸。有机碱（嘌岭、嘧啶）和戊糖（核糖、脱氧核糖）。

此三类化合物可用下列方法鉴定之。

1、磷酸：能与钼酸试剂作用生成磷钼酸，后者在还原剂的作用下。还原成兰色的钼兰。常用的还原剂有氨基苯磺酸、氯化亚锡，维生素C等。

H3PO4＋12H2MoO4→H3PO4·12MoO3 + 12H2O

H3PO4·12MoO3

H3PO4·6MoO3 ·3Mo2O5

2、嘌呤碱：能与苦味酸作用形成针状结晶

3、戊糖：

(1)核糖：经与强酸(盐酸与硫酸)共热生成糠醛，后者可与3;5二羟甲基苯缩合成绿色化合物。

(2)脱氧核糖：在强酸中加热，可生成ω—羟基γ—酮基戊醛，后者再与二苯胺作用生成一蓝色化合物。

上述二反应如下

【操 作】

(一)核酸提取

l、用酚提取法：

（1）取小白鼠一只，断头处死，剖腹取肝，置于研钵中，加入玻璃少许，研磨至糊状后，加入蒸馏水3ml，继续研磨约三分钟。

（2）于该研钵中再加酚液5ml，研磨约十分钟后，倒入—-圆底离心管中，离心5分钟（约2000转/分钟）。

（3）用毛细管将上液吸出，置于一圆底离心管中，加乙醚2ml，用拇指将管口按住，用力振摇1—2分钟(提出酚)，离心5分钟后，用毛细滴管吸取全部下层液于一圆底离心管中。

（4）于该管中加入95％乙醇2ml，用玻棒搅拌约2分钟，离心3分钟，取出．去上清液，沉淀部分即为核酸。

…… …… 余下全文

细胞实验报告

一 细胞显微形态的观察

实验目的：

         观察各种组织装片，了解各种细胞的形态结构特点，注意细胞形态与功能的联系。

实验原理：

         细胞是生物体结构和功能的基本单位。由于其内在结构、自身表面张力及其外部机械压力等因素的存在，细胞呈现出多种多样的形态，有球形、圆柱形、立方形、多边形的等。细胞的形态结构和它的功能是相适应的，如人血红细胞为双面凹的圆饼形，利于进行气体的交换及在血管中的流动。执行不同生理功能的细胞往往具有不同的形态，在不同的生物体中，之行同一种功能的细胞也可能具有不同的形态，甚至有些细胞在其不同的发育阶段也呈现出不同的形态。

         虽然细胞的大小及形态有很大的差距，但是都具有共同的基本结构，即都是由细胞膜、细胞质和细胞核组成的。生活状态下的大多数细胞及其内部结构都是无色的，故在进行观察的时候，需要对组织细胞进行染色。

实验材料：

1 动植物组织装片标本

2 显微镜、镜油、擦镜液(无水乙醇与无水乙醚的体积比为3:7)、擦镜纸

实验步骤：

观察动植物不同组织的装片。

1 单层扁平上皮

         构成此种组织的细胞呈扁平状，轮廓为多边形或不规则的波浪形；细胞在组织基膜上呈单层排列，彼此的边缘互相嵌合；细胞核为扁圆形。

2 单层柱状上皮

         细胞呈柱状，排列十分紧密；细胞核为卵圆形，位于细胞的中部或底部。

…… …… 余下全文

动物细胞培养

一、试验目的。

1、掌握无菌操作技术。

2、掌握原代和传代细胞培养。

3、掌握细胞冷冻和复苏技术。

4、了解培养成纤维细胞的形态。

二、试验原理。

将动物机体的组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。

细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

对具有移动特性的稳定细胞系或细胞株进行长期保存，一方面可以作为细胞研究的试验材料，另一方面可以做细胞制品的生产材料。目前广泛应用的细胞保存方法是低温冷冻保存法，。细胞的冷冻保存的原则是慢冻快融，这样做是为了防止细胞由于冷冻过程中产生了冰晶而发生细胞破裂。

三、实验器材及药品。

器材：怀孕的小白鼠、培养箱、培养瓶、培养皿、移液器、眼科剪、镊子、酒精灯、离心机、水浴锅、倒置显微镜、CO₂培养箱、超净工作台、离心管、高压灭菌锅、试管架等。

药品：小牛血清、DMEM合成培养基、抗生素、DMSO冷冻剂、胰酶、PBS缓冲液等。

四、实验操作。

1、消毒灭菌。

将实验所需用到的工具（如枪头、培养皿、眼科剪、镊子以及每个人的实验服等）集中灭菌、烘干。配制75%的酒精以备实验时所需。

2、培养基的配制。

分别取10ml的小牛血清、90ml的DMEM合成培养基，将两种培养基混合在一起，再向其中加入1ml的抗生素，吹打混匀就得到了细胞培养的培养液。

3、原代培养。

（1）、准备。将实验过程中会用到的工具以及药品全部放在超净工作台上进行紫外消毒灭菌。实验开始前带好乳胶手套，用酒精对手进行消毒。将怀孕的小白鼠放在酒精中杀死，取出子宫内的胚胎组织。

…… …… 余下全文

动物细胞培养技术

实验报告

生物技术1004班 第四组

实验一仪器的清洗与灭菌及培养基的配制

一、实验目的

能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。

二、实验原理

清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。常用的消毒灭菌方法有： (1)紫外线消毒 用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。这是常使用的消毒方法之一。

(2)湿热灭菌 此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。 (3)滤过除菌   用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤器型号按直径大小划分。以0．22 μm除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。(4)化学消毒法   70％(或75％)酒精：超净台里常备70％酒精棉球(卫生级酒精)，用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。

三、实验材料、用品

1．材料：   PH试纸、三蒸水、量筒 烧杯（1000ml 2个250ml 4个100ml2个10ml 3个）、玻璃棒（3个）、250ml盐水瓶（8个）10ml盐水瓶(10个)  250ml玻璃螺口培养瓶（27支） 1.5ml离心管一瓶 微量可调移液器3个（1000ul配套枪头2盒） 注射滤器（0.22微米微孔滤膜）（4只） 带旋盖离心管10ml （3个）、离心管架一个 1把小镊子，3把剪刀，3把弯镊 3个100目钢丝筛网 牛皮纸 橡胶皮筋 标签纸 记号笔若干

…… …… 余下全文