一、实验名称：质粒DNA的提取与纯化，DNA琼脂糖凝胶电泳

二、实验原理：

1.质粒DNA的提取：

质粒是一类存在于几乎所有细菌等微生物中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的DNA分子，能够自主复制和稳定遗传，以超螺旋形式存在，是最常用的基因克隆载体。除质粒外，大肠杆菌中还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂质等物质，因此需要裂解细胞并除去蛋白质和染色体DNA等物质才能分离纯化出质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验使用碱裂解法，即利用SolutionⅠ 、Ⅱ、Ⅲ三种溶液分离提取质粒DNA.其原理如下。

（1）碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理：

碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA之间变性与复性的差异来分离质粒DNA，达到分离提纯质粒DNA的目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，线性的DNA因氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的大部分氢键会被断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链相互缠绕，不会完全分离。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性，恢复其天然构象，以可溶状态存在于液相中；而线性的染色体DNA由于两条互补链彼此已完全分开、分子量大、结构复杂而相互缠绕形成不溶性网状结构。与不稳定的大分子RNA、变形的蛋白质以及细菌碎片等一起沉淀而被除去。进一步用酚、氯仿使蛋白质变性去除蛋白质杂质，然后用无水乙醇沉淀，即可获得纯化的质粒DNA。SolutionⅠ 、Ⅱ、Ⅲ三种溶液以及无水乙醇沉淀DNA的具体作用和原理如下。

（2）四种溶液作用及原理：

①Solution I的作用：悬浮大肠杆菌菌体，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉，从而起到抑制DNA酶对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。另外也可保证溶菌酶活性。

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实验3转基因植物PCR检测

三、植物基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测

一、实验目的

学习水平式琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。

二、原理

DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片段的分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，可作为电泳支持物，适用于分离大小范围在0.2-50kb的DNA片段。DNA分子的迁移率与分子量的对数值成反比关系。观察其迁移距离，与标准DNA片段进行对照，就可获知该样品分子量大小。可通过琼脂糖凝胶电泳上显示的DNA带来分析DNA的完整性和浓度。因为EB作为一种荧光染料，能插入DNA的碱基对平面之间而结合于其上，在紫外光的激发下产生荧光，DNA分子上EB的量与DNA分子的长度和数量成正比。在电泳时加入已知浓度的DNAMarker作为DNA分子量及浓度的参考，样品DNA的荧光强度就可以大致表示DNA量的多少。这种方法的优点是简便易行，可结合琼脂糖凝胶电泳分析DNA样品的完整性来进行，缺点是不太准确。

三、实验样品

提取的甘薯基因组DNA。

四、试剂

4.1 溴酚蓝指示剂点样缓冲液：0.2% 溴酚蓝和50% 蔗糖

4.2 1mg/ml溴化乙锭溶液

4.3 电泳缓冲液（TAE）：40 mmol/L Tris-乙酸和1 mol/L EDTA。24.2克Tris碱，5.71ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至5000ml。

4.4 1.0% 琼脂糖凝胶：称取琼脂糖0.50克，加入50ml TAE电泳缓冲液。

五、仪器

5.1 离心管；

5.2 微量移液器；

5.3 吸头；

5.4 电泳仪；

5.5 电泳槽；

5.6 透射紫外观察仪

六、实验步骤

6.1 DNA的琼脂糖凝胶电泳

6.1 选择合适的水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平。检查稳压电源与正负极的线路。

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植物总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测

（20##级生态班实验方案）

一、      实验目的

1.         理解用CTAB法提取植物组织DNA的原理。

2.         掌握CTAB法提取植物组织DNA的方法。

3.         了解真核基因组DNA的有关特性。

二、      实验原理

由于植物细胞含有细胞壁及其细胞内高含量的多糖物质，因此一般的提取真核细胞基因组DNA的方法用在植物细胞上并不十分有效。十六烷基三乙基溴化铵（cetyltriethy lammonium bromide, CTAB）法是常用的提取植物细胞基因组DNA的方法。CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）时，CTAB-核酸复合物是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸复合物与蛋白质、多糖类物质分开。CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。再经过氯仿/异戊醇(24:1)抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA ，最后经异丙醇或乙醇等 DNA 沉淀剂将DNA沉淀分离出来。

植物DNA的提取程序应包括以下几项：①必须破碎或消化细胞壁释放出细胞内容物；②必须破坏细胞膜及核膜，使DNA释放到提取缓冲液中，常用CTAB一类的去污剂使细胞膜崩解；③DNA粗提物中往往含有大量RNA、蛋白质、多糖等杂质，可利用氯仿、RNase等除去。一旦DNA释放出来，其剪切破坏的程度必须要降到最低。CTAB法提取植物DNA，方法比较简单，适用于大多数植物。虽然得到的DNA纯度不是很高，但仍能满足限制性内切核酸酶分析或PCR扩增的要求。

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授课教师常祖明                                学生人数 55                                 

课    题 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测                                                        

授课类型新授课                                授课方法讲授、演示                         

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实验七 DNA的琼脂糖凝胶电泳（4学时）

实验目的

琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本实验学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。

实验原理

琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA

核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时，单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。

影响核酸分子泳动率的因素主要是：

1、样品的物理性状

即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言，电荷密度愈大，泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。

对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此标准样品电泳并测定其泳动率，然后进行DNA分子长度（bp）的负对数——泳动距离作标准曲线图，可以用于测定未知分子的长度大小。

DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：cDNA＞IDNA＞ocDNA但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。

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龙志敏   200930220121  09制药一班

实验四DNA的琼脂糖凝胶电泳

一、实验目的

1、掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。

2、学习凝胶成像系统的使用。

二、实验原理

琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA 片段的常用技术，适用于大小在0.2kb～50kb范围内的DNA片段的分离。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA， 也可以分离相对分子质量相同，而构型不同的DNA分子。在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。

在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidium bromide, EB)，其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，因此可对分离的DNA进行检测。由于EB具有强致癌作用，现已逐渐改用EB替代染料，如GelRed、SYBR Green 、Goldview等。

三、仪器及试剂

1、仪器及耗材

水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、微波炉、微量移液器、100 mL或250 mL锥形瓶、量筒、吸头等

2、试剂

（1）50×TAE缓冲液(2 M Tris-乙酸，0.05 M EDTA) ：称取60.5 g Tris，用双蒸水搅拌溶解，加入14.3 mL冰乙酸和25 mL 0.5 M EDTA(pH 8.0)，并定容至250mL，高压灭菌，室温保存。

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多聚酶链式反应（PCR）扩增DNA片段及琼脂糖凝胶电泳产物检测

一、实验目的：

1、了解PCR技术的基本操作

2、理解PCR的原理

3、讨论PCR的应用

二、实验原理：

PCR是一种在体外模拟细胞内环境进行迅速扩增DNA片段的技术，这一技术需要模板、四种脱氧核苷酸等组分条件外，还需要不同温度环境以进行DNA的解旋和聚

1、PCR反应组分

细胞内DNA复制条件分析：

此外，试验中用到的还有Mgcl2，Mg2+能激活酶的活性；10* Buffer 缓冲液，为Taq酶提供合适的PH条件。

2、PCR反应条件

PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。

PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸。

(!)变性（模板DNA解旋）

模板DNA经加热至90℃以上。一定时间后，使模板DNA双链解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。

(2)复性（退火）

模板DNA经加热变性成单链后，温度降到50℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

(3)延伸

DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链。

3、PCR产物的检测

(1)紫外分光光度计

DNA在260nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，可以通过与蒸馏水的对比进而计算扩增出DNA的含量。

(2)琼脂糖凝胶电泳

DNA在电厂作用下，可以由电源的负极向正极泳动，泳动的速度与DNA片段的长度成负相关，与电压强度成正比，因此可以分离不同长度的DNA。在有DNA marker（不同已知碱基对大小的DNA片段的混合物）的条件下，由于不同碱基大小的DNA片段在琼脂糖凝胶上涌动的速度不同，因此电泳完毕后会出现在胶块的不同位置。通过将扩增出的DNA片段与已知的条带做比较，可以大概推测出该片段的碱基对的大小。如果要进一步检测其大小，可以换另外规格的DNA marker 继续电泳。核酸荧光染料可以与DNA嵌合，一起电泳，DNA图谱观察仪可以激发特定的蓝色光源，荧光染料在该光照射下可见到荧光，荧光的亮度与DNA大小成正比。

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