实验名称 碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析
实验日期 20##年10月25号 实验地点 生化实验室
合作者 指导老师
总分 教师签名 批改日期
碱性磷酸酶(AKP或ALP)是一种底物特异性较低,在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶,需要镁和锰离子为激活剂。AKP具有磷酸基团转移活性,能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上,如磷酸基团的接受体是水,则其作用就是水解。AKP最适PH范围为8.6-10,动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。血清AKP主要来自肝,小部分来自骨骼。
AKP可从组织中分离纯化,也可以采用基因工程表达的方式获得:将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体,转入宿主菌中进行重组表达,并从表达菌提取,并进行酶动力学分析。
一 实验原理
1、碱性磷酸酶的分离纯化
AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似,常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。有时需要多种方法配合使用,才能得到高纯度的酶蛋白。本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。正丁醇能使部分杂蛋白变性,过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液,AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中,而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中,通过离心即可得到初步纯化的AKP。
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