实验三  血清总胆固醇的测定

目的要求

    了解并掌握胆固醇测定的原理和方法。

实验原理

    血清胆固醇(chol)测定是动脉粥样硬化性疾病防治、临床诊断和营养研究的重要指标。正常人血清胆固醇含量范围为100 ~ 250mg/mL。

胆固醇是环戊烷多氢菲的衍生物，它不仅参与血浆蛋白的组成，而且也是细胞的必要结构成分，还可以转化成胆汁酸盐、肾上腺皮质激素和维生素D等。胆固醇在体内以游离胆固醇及胆固醇酯两种形式存在，统称总胆固醇。总胆固醇的测定有化学比色法和酶学方法两类。本实验采用前一种方法。

    胆固醇及其酯在硫酸作用下与邻苯二甲醛产生紫红色物质，此物质在550nm波长处有最大吸收。因此，可用比色法作总胆固醇的定量测定。胆固醇含量在400mg/100mL以内时，与光吸收值呈良好线性关系。

本法不必离心，颜色产物也比较稳定。

试剂和器材

一、试剂

邻苯二甲醛试剂：称取邻苯二甲醛50mg，以无水乙醇溶至50mL冷藏，有效期为一个半月。

混合酸：冰乙酸100mL与浓硫酸100mL混合。

标准胆固醇贮存液（1mg/mL）：准确称取胆固醇100mg，溶于冰乙酸中，定溶至100mL。

标准胆固醇工作液（0.1mg/mL）：将上述贮存液以冰乙酸稀释10倍，即取10mL用冰

乙酸稀释至100mL。

二、测试样品

0.1mL人血清以冰乙酸稀释至4.00mL。

三、器材

试管1.5×15cm（×11）；移液枪，量筒50mL分光光度计。

操作方法

    一、制作标准曲线

取9支试管编号后，按下表顺序加入试剂：

加毕，温和混匀，20～37℃下静置10分钟，在550nm波长处测定光吸收值。以总胆固醇量（mg%）为横坐标，光吸收值为纵坐标做出标准曲线。

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实验七 胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇

实验八 二乙酰一肟法测定血清尿素

课程名称：生物化学与分子生物学实验课 年级：2005 专业、层次：临床、营养与食品、口腔本科 授课教师：符伟玉 职称：讲师 基本教材：自编 《生物化学与分子生物学实验指导》

教学目的与要求：

1、掌握酶法测定总胆固醇的原理和方法。 2、学习用比色法测定血清尿素。 3、巩固有关胆固醇和尿素的知识。

4、进一步熟练UV2100型分光光度计的使用。

大体内容与时间安排：

1、氧化酶法测定总胆固醇的原理 2、氧化酶法测定总胆固醇的注意事项 3、二乙酰一肟法测定血清尿素的原理 3、二乙酰一肟法测定血清尿素的注意事项 4、学生做实验

教学方法：讲授式+启发式

教学重点、难点：

重点：1、氧化酶法测定总胆固醇的原理

2、二乙酰一肟法测定血清尿素的注意事项 难点：氧化酶法测定总胆固醇的原理

学时：4学时 5min 5min 5min 5min 140min

一、实验原理

（一）氧化酶法测定血清总胆固醇

血清总胆固醇(TC)包括：游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)两部分。本实验是

胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化物酶相偶联发生的偶联反应。

第一步：血清胆固醇酯可被胆固醇酯酶水解为游离胆固醇和游离脂肪酸

(FFA) 。

第二步：胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成△4-胆甾烯酮和H2O2。

第三步：H2O2在4-氨基安替比林和酚存在时，经过氧化物酶催化，反应生

成苯醌亚胺非那腙的红色醌类化合物，其颜色深浅与标本中TC含 量成正比。

（二）二乙酰一肟法测定血清尿素

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实验七、血清胆固醇的定量测定（磷硫铁法）

实验目的：

掌握磷硫铁法测定血清胆固醇的原理、方法及临床意义。

实验原理：

总胆固醇的测定有化学比色法(磷硫铁法和邻苯二甲醛法)和酶学方法(试剂盒)两类。本实验采用磷硫铁法测定血清胆固醇含量。

用无水乙醇提取血清中的胆固醇，再与硫磷铁试剂作用，产生颜色反应，呈色度与胆固醇含量成正比，可用比色法测定血清中胆固醇含量。

血清经无水乙醇处理，蛋白质被沉淀，胆固醇及其酯溶解在无水乙醇。在乙醇提取液中，加磷硫铁试剂，胆固醇及其酯与试剂形成比较稳定的紫红色化合物，此物质在560nm波长处有特征吸收峰，可用比色法作胆固醇的定量测定。正常血清中胆固醇的含量有随年龄增大而增加的趋势，其平均正常值在110～220mg/100ml。

胆固醇含量在400mg/100ml内，与A（或OD）值呈良好线性关系。

实验讲授：

722型分光光度计的使用

    测量原理
    分光光度法测量的理论依据是伯郎—比耳定律：当容液中的物质在光的照射和激发下，产生了对光吸收的效应。但物质对光的吸收是有选择性的，各种不同的物质都有其各自的吸收光谱。所以根据定律当一束单色光通过一定浓度范围的稀有色溶液时，溶液对光的吸收程度A与溶液的浓度c（g/l）或液层厚度b (cm) 成正比。其定律表达式A = abc（a是比例系数）。当c的单位为mol/l时，A = εbc，比例系数用ε表示，称为摩尔吸光系数。其单位为L·mol-1·cm-1，它是有色物质在一定波长下的特征常数。
    T (透光率) = I/I₀ A (吸光度) = -lgT 或 A = K·C·L (比色皿的厚度)
    测定时，入射光I, 吸光系数和溶液的光径长度不变时，透过光是根据溶液的浓度而变化的，即“K”为常数。比色皿厚度一定，“L”、“I₀”也一定。只要测出A即可算出“C”。《分光光度计的表头上，一行是透光率，一行是吸光度。》

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生物化学与分子生物学设计实验 （胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇及二乙酰一肟

法测定血清尿素）

小组成员：

班级：麻醉11-2班

日期：20xx年12月19

胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇及二乙酰一肟法

测定血清尿素

实验目的

1、掌握酶法测定总胆固醇的原理和方法。

2、学习用比色法测定血清尿素。

3、巩固有关胆固醇和尿素的知识。

4、进一步熟练UV2100型分光光度计的

重点、难点：

重点：1、氧化酶法测定总胆固醇的原理

2、二乙酰一肟法测定血清尿素的注意事项

难点：氧化酶法测定总胆固醇的原理

一、实验原理

（一）氧化酶法测定血清总胆固醇

血清总胆固醇(TC)包括：游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)两部分。本实验是

胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化物酶相偶联发生的偶联反应。

第一步：血清胆固醇酯可被胆固醇酯酶水解为游离胆固醇和游离脂肪酸

(FFA) 。

第二步：胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成△4-胆甾烯酮和H2O2。

第三步：H2O2在4-氨基安替比林和酚存在时，经过氧化物酶催化，反应生

成苯醌亚胺非那腙的红色醌类化合物，其颜色深浅与标本中TC含 量成正比。

（二）二乙酰一肟法测定血清尿素

二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜

色深浅与尿素含量成正比。因二乙酰不稳定，故由试剂中二乙酰一肟与强酸作用

产生二乙酰。

二、操作步骤

（一）氧化酶法测定血清总胆固醇

2

终点法检测TC，取试管3支按下表依次加样。

酶法测定TC操作步骤

加入物(μl) 血清 标准液或定值血清

蒸馏水 酶试剂

空白管 － － 20 1 000

标准管 － 20 － 1 000

测定管 20 － － 1 000

混匀后，37℃保温10 min，每管加3ml水混匀，用分光光度计比色，于500 nm波长处以空白管调零，读出各管吸光度。

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教案首页

第__5__次课                             授课时间：20##年11月29日～11月30日

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血清总胆固醇测定操作规程

A1．2 原理

血清中的胆固醇酯(CE)被胆固醇酯水解酶(CEH)水解成游离胆固醇(Chol)，后者被胆固醇氧化酶(CHOD)氧化成△4—胆甾烯酮，并产生过氧化氢，再经过氧化物酶(POD)催化4—氨基安替比林与酚(三者合称PAP)，生成红色醌亚胺色素(Trinder反应)。醌亚胺的最大吸收在500nm左右，吸光度与标本中总胆固醇呈正比。反应式如下：

胆固醇酯+H2O CEH 胆固醇+游离脂肪酸

胆固醇+02 CHOD △4-胆甾烯酮十H202

2H202+4－氨基安替比林+酚 POD 昆亚胺+4H2O

A1．3 标本采集与处理

对于血脂分析，特别需要强调“分析前”各个环节的质量管理。

A1．3．1 受检者(体检对象或病人)的准备：除总胆固醇不一定用空腹血外，测定甘油三酯、脂蛋白与载脂蛋白的病人必须空腹12h，不饮酒24h后采集血样。对于体检对象抽血前应有2周时间保持平时的饮食习惯，近期内体重稳定，无急性病、外伤、手术等意外情况。妊娠后期各项血脂都会增高，应在产后或终止哺乳后3个月检验才能反映其基本血脂水平。注意有无应用影响血脂的药物，如降血脂药、避孕药、噻嗪类利尿剂、β受体阻滞剂、免疫抑制剂、某些降压剂、降糖药、胰岛素及其他激素制剂等，检验以前应根据所用药物的特性停止用药数天或数周，否则应记录用药情况。对体检对象及做前瞻性观察者，还应注意采血的季节，因为血脂水平有季节性变动，为了前后比较应在每年同一季节检验。应嘱体检对象在抽血前24h内不作剧烈运动。

A1．3．2 静脉采血：除非是卧床的病人，一般在采血时取坐位。体位影响水分在血管内外的分布，因此影响血脂水平。例如站立5 min可使血脂浓度提高5％，15 min提高16％，故在采血前至少应***5min。一般从肘静脉取血，使用止血带的时间不超过1 min，穿刺成功后立即松开止血带。静脉阻滞5min可使甘油三酯增高10％～15％。

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一、目的

胆固醇是类固醇的一种，人体中胆固醇除来自食物外还可在体内由乙酰

辅酶A合成。胆固醇在维持机体正常功能上非常重要，它是所有细胞膜与亚细胞膜的构成成分，是胆汁酸的唯一前体，也是所有类固醇激素包括性腺与肾上腺激素的前体。由于胆固醇不断地进出于血流，故胆固醇的测定可反映其摄取，合成及携带胆固醇各种脂蛋白的合成速度及影响脂蛋白代谢的受体情况。

二、测定方法

酶法

三、原理

先用胆固醇酯酶将胆固醇酯水解成游离胆固醇，再经胆固醇

氧化酶作用生成过氧化氢，后者在过氧化物酶作用下与发色剂作用生成红色化合物，显色与胆固醇含量成正比。

四.标本

1.作血浆脂质、脂蛋白分析应在空腹12小时以后抽血，抽血前两

天忌食高脂食品，24小时内不饮酒。

2、静脉抽取病人空腹血，臵于洁净干燥试管或含促凝剂的真空采血管内。

3、采血后应立即送到检验科生化室。

4、样品收到后立即分离血清。

五、设备及试剂

1、希迈全自动生化仪。

2、上海复星长征公司胆固醇试剂。

3、胆固醇试剂应贮存于2—8℃冰箱。

六、操作步骤

1、样本的准备：将编好号的样品离心，取血清加入样品杯放到

样品盘的规定位臵，再把样品盘放到仪器中相应位臵。

2、试剂的检查：每天测定前先检查各种试剂的数量、效期、定

标等情况，确认无误后方可进行测定。

3、操作方法：详见希迈生化仪操作手册。

七、质量控制

每天操作过程中应使用上海复星长征公司的生化质控血清

至少做一次室内质控，每年定期参加海南省临检中心所组织的室间质评。

八、干扰因素

1 、黄疸血清和服用还原性药物如：VitC可使结果假性下降。

九、参考区间

3.2-6.1mmol/L

十、实验室解释

1、血清胆固醇增高见于脂肪肝，肝脏肿瘤等，后者因其压通胆管可使胆固醇随胆汁排除的量减少，血清中量增高。肝外疾病如：甲减，严重糖尿病，动脉粥样硬化，肾综合征等也可见胆固醇增高。妊娠中后期也会升高。家族性胆固醇血症时会显著升高。

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