实验一  蛋白质及氨基酸的呈色反应

一、实验目的

1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式

2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理

3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法

二、实验原理

1. 双缩脲反应(biuret reaction)

蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。

2. 茚三酮反应(ninhydrin reaction) 

蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。  

3.苯环的黄色反应

Tyr

Trp

Phe+少量浓硫酸+浓硝酸                        黄色

4. 乙醛酸的反应：

     检测Trp或含Trp蛋白质的反应。当Trp与乙醛酸和浓硫酸在试管中滴加时，产生分层现象，界面出现紫色环。主要是由于蛋白质中的吲哚环作用。

5. 偶氮反应

         偶氮化合物都含有-N=N-这样结构，通常作为染料。

6. 醋酸铅反应

三、实验步骤

1. 双缩脲反应(biuret reaction)

取1支试管，加乳蛋白溶液（蛋清：水= 1：9）约1ml和10%NaOH约2ml，摇匀，再加1%CuSO4溶液2滴，随加随摇。观察现象，记录。

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实验五 蛋白质的性质实验——蛋白质及氨基酸的呈色反应

一、实验目的

1．了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。

2．了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。

3．学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。

Ⅰ 双缩脲反应

二、实验原理

尿素加热至180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。

因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。

三、材料、仪器与试剂

尿素；10%氢氧化钠溶液；1%硫酸铜溶液；2%卵清蛋白溶液

四、实验操作

取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10%氢氧化钠溶液约1ml，振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。

向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml和10%氢氧化钠溶液约2ml，摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。

Ⅱ 茚三酮反应

二、实验原理

除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。

β—丙氨酸、氨和许多一级胺都呈阳性反应。尿素、马尿酸、二酮吡唪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。

三、材料、仪器与试剂

蛋白质溶液；2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；0.5%甘氨酸溶液；0.1%茚三酮水溶液；0.1%茚三酮-乙醇溶液

四、实验操作

①取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1~2分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。

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实验三蛋白质及氨基酸的呈色反应

一、实验目的

1、了解蛋白质和某些氨基酸的特殊颜色反应及其原理

2、掌握几种常用鉴定蛋白质和氨基酸的方法

二、实验内容

    对蛋白质及氨基酸的双缩脲反应、茚三酮反应、黄色反应、乙醛酸反应、偶氮反应、醋酸铅反应等颜色及沉淀反应进行定性确定。

三、实验操作

（一）   双缩脲反应

1、实验原理

当尿素加热到180℃左右时，两个分子的尿素缩合可放出一个分子氨后形成双缩脲，双

缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的红色配合物，此呈色反应称为双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有多个肽键，其结构与双缩脲相似，故能呈此反应，而形成紫红色或蓝紫色的配合物。此反应常用作蛋白质的定性或定量的测定。

2、试剂

(1)尿素

(2)10%NaOH溶液

(3)1%CuSO₄溶液

(4)蛋白质溶液：将鸡蛋清用蒸馏水稀释10~20倍，3层纱布过滤，滤液冷藏备用。

3、操作

（1）取少许结晶尿素放在干燥试管，微火加热，则尿素开始熔化，并形成双缩脲，释放的氨可用湿润的红色石蕊试纸鉴定。待熔融的尿素开始硬化，试管内有白色固体出现，停止加热，让试管缓慢冷却。然后加10% NaOH溶液 1 ml和1% CuSO­4 2~3滴，混匀后观察颜色的变化。

（2）另取一试管，加蛋白质溶液 1ml、10% NaOH溶液2ml及1% CuSO₄ 2~3滴，振荡后将出现的紫红色与双缩脲反应所产生的颜色相对比。

（二）   茚三酮反应

1、实验原理

除脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮作用生成黄色物质外，所有α-氨基酸与茚三酮发生反应

生成紫红色物质，最终形成蓝紫色化合物。1︰1500000浓度的氨基酸水溶液即能发生反应而显色。反应的适宜pH为5~7。此反应目前广泛地应用于氨基酸定量测定。

2、试剂

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,实验二蛋白质及氨基酸的呈色反应

一、实验目的

1、了解蛋白质和某些氨基酸的特殊颜色反应及其原理

2、掌握几种常用鉴定蛋白质和氨基酸的方法

二、实验内容

    对蛋白质及氨基酸的双缩脲反应、茚三酮反应、黄色反应、乙醛酸反应、偶氮反应、醋酸铅反应等颜色及沉淀反应进行定性确定。

三、实验操作

（一）   双缩脲反应

1、实验原理

当尿素加热到180℃左右时，两个分子的尿素缩合可放出一个分子氨后形成双缩脲，双

缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的红色配合物，此呈色反应称为双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有多个肽键，其结构与双缩脲相似，故能呈此反应，而形成紫红色或蓝紫色的配合物。此反应常用作蛋白质的定性或定量的测定。

2、试剂

(1)尿素

(2)10%NaOH溶液

(3)1%CuSO₄溶液

(4)蛋白质溶液：将鸡蛋清用蒸馏水稀释10~20倍，3层纱布过滤，滤液冷藏备用。

3、操作

（1）取少许结晶尿素放在干燥试管，微火加热，则尿素开始熔化，并形成双缩脲，释放的氨可用湿润的红色石蕊试纸鉴定。待熔融的尿素开始硬化，试管内有白色固体出现，停止加热，让试管缓慢冷却。然后加10% NaOH溶液 1 ml和1% CuSO­4 2~3滴，混匀后观察颜色的变化。

（2）另取一试管，加蛋白质溶液 1ml、10% NaOH溶液2ml及1% CuSO₄ 2~3滴，振荡后将出现的紫红色与双缩脲反应所产生的颜色相对比。

（二）   蛋白黄色反应

1、实验原理

蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等，这类蛋白质可

被浓硝酸硝化生成黄色的硝基苯的衍生物。该物质在酸性环境中呈黄色，在碱性环境中转变为橙黄色的硝醌酸钠。绝大多数蛋白质都含有芳香族氨基酸，因此都有黄色反应。皮肤、毛发、指甲等遇浓HNO₃变黄即发生此类黄色反应结果。

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实验二       蛋白质及氨基酸的呈色反应

【实验目的】

1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。

2.了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。

3.学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。

（一）双缩脲反应

【实验原理】

?    尿素加热至180℃左右生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。

?    一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。

 

【实验器材及试剂】

器材：

试管、酒精灯、试管夹、试管架

试剂：

（1）尿素

（2）10%氢氧化钠溶液

（3）1%硫酸铜溶液

（4）2％卵清蛋白溶液

【实验步骤】

?    取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10％氢氧化钠溶液约1毫升，振荡混匀，再加1％硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。

?    向另一试管加卵清蛋白溶液约l毫升和10％氢氧化钠溶液约2毫升，摇匀，再加1％硫酸铜溶液2滴，随加随摇，观察紫玫色的出现。

（二）茚三酮反应

【实验原理】

?    除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。

?    该反应十分灵敏，1：1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。

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实验十一蛋白质与氨基酸的显色反应

一、实验目的

1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。

2、了解蛋白质和某些氨基酸的显色反应原理。

3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。

（一）双缩脲反应

1、实验原理

尿素加热至180℃左右生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与cu²⁺结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。

一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。

2、实验器材及试剂

（1）器材：  试管、酒精灯、试管夹、试管架

（2）试剂： 1）尿素 

2）10%氢氧化钠溶液

3）1%硫酸铜溶液

4）2%卵清蛋白溶液，或新鲜鸡蛋清溶液（将鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3层纱布过滤，滤液冷藏备用）。

3、实验步骤

（1）取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10%氢氧化钠溶液约1毫升，振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。 

（2）向另一试管加卵清蛋白溶液约1毫升和10%氢氧化钠溶液约2毫升，摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇，观察紫玫色的出现。

（二）茚三酮反应

1、实验原理

除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。该反应十分灵敏，1：1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。

茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分于和氨缩合生成有色物质。此反应的适宜pH为5-7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。此反应目前广泛地应用于氨基酸定量测定。

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实验9  蛋白质及氨基酸的颜色反应

一、目的和要求

1、了解蛋白质和某些氨基酸的特殊颜色反应及其原理

2、掌握几种常用鉴定蛋白质和氨基酸的方法

二、试剂

1.         鸡蛋清。

2.         蛋白质溶液：将鸡蛋清用蒸馏水稀释10~20倍，3层纱布过滤，滤液冷藏备用。

3.         10% NaOH溶液；20% NaOH。

4.         浓硝酸（比重1.42）；浓盐酸；浓硫酸（分析纯）；冰醋酸（一般含有乙醛酸杂质，故可用冰醋酸代替乙醛酸）。

5.         1% CuSO₄溶液。

6.         10% Pb(Ac)₂溶液（醋酸铅溶液）。

7.         醋酸铅试纸：将滤纸条浸入10% 醋酸铅溶液中，湿透后取出，100℃烘干即可。

8.         0.5% 甘氨酸溶液。

9.         0.3% 色氨酸溶液。

10.     0.3% 酪氨酸溶液。

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