实验三 菌种的分离纯化技术——平板划线法

实验目的

了解平板划线分离纯种的原理，并熟练掌握该操作法。

实验内容

1．培养基平板的制备。

2．用平板划线分离法分离混菌。

实验原理

平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。

划线的形式有多种，可将一个平板分成四个不同面积的小区进行划线,第一区(A区)面积最小，作为待分离菌的菌源区，第二和第三区(B、C区)是逐级稀释的过渡区，第四区(D区)，则是关键区，使该区出现大量的单菌落以供挑选纯种用。为了得到较多的典型单菌落,平板上四区面积的分配应是D＞C＞B＞A。

实验器材

大肠杆菌、枯草芽孢杆菌混合菌悬液

牛肉膏蛋白胨培养基

无菌培养皿，水浴锅，接种环等。

实验步骤

1．融化培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基放入水浴中加热至融化。

2．倒平板：待培养基冷却至50℃左右，按无菌操作法倒2只平板(每皿约15m1)，平置，待凝固。

倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管(瓶)塞(也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中)。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速例入培养基约15m1，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。

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       南昌大学实验报告

学生姓名：                   学    号：                   专业班级：                  

实验类型：√ 验证 □ 综合 □ 设计 □ 创新   实验日期：            实验成绩：            

实验八细菌纯种分离、培养和接种技术

一、实验目的：                                                                                           

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实验六  平板划线法分离菌种

一、实验目的

1、了解平板划线法分离菌种的基本原理

2、练习平板划线法分离菌种的基本操作，掌握无菌操作技术

二、实验原理

    平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可形成一个单菌落，故在科学研究中，特别是在菌种鉴定等工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。

    平板划线分离对细菌、酵母菌较为适宜，而霉菌和放线菌的分离多采用稀释分离法进行菌种的分离纯化。

    具体的划线形式有多种，这里仅介绍一种经过长期实践并证明可获得良好实验效果的方法：将一个平板分成A、B、C、D4个面积不同的小区进行划线，A区面积最小，作为待分离菌的菌源区，B和C区为经初步划线稀释的过渡区，D区则是关键的单菌落收获区，它的面积最大，出现单菌落的概率也最高。由此可知，这4个区的面积安排应做到D>C>B>A。

    鉴别培养基是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助于快速鉴别某种微生物。这样的培养基称之为鉴别培养基。例如用以检查饮水和乳品中是否含有肠道致病菌的伊红美蓝培养基就是一种常用的鉴别性培养基。（参考GB4789.38-2012食品安全国家标准   食品微生物学检验 大肠埃希氏菌计数）

其配方中含有乳糖、伊红和美蓝，用以鉴别肠道病原菌及其他杂菌。伊红、美蓝作为指示剂，伊红系酸性染料，当大肠埃希氏菌或产气肠杆菌分解乳糖产酸时，由于细菌带正电荷，所以被伊红着色。在大肠埃希氏菌中因为伊红与美蓝结合，所以菌落不呈红色，而是蓝紫黑色，且具有绿色金属光泽；菌落呈棕色者为产气肠杆菌；不分解乳糖的肠道病原菌则不着色，有时因产生碱性物质较多，细菌带负电荷，被美蓝着色后，菌落并不呈蓝色，因美蓝与伊红结合，所以菌落为淡紫色。

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平板划线法操作步骤

1.操作前准备：将接种环2支，酒精灯2个，打火机2个，无菌平板两包，酒精棉球2瓶，镊子2个，洁净烧杯2个置于超净工作台，打开紫外灯，灭菌30分钟。取待纯化菌种2支放入超净工作台。操作者直立坐于操作台前，打开操作台玻璃，高度可供双手顺利出入即可。

2.擦拭：用镊子取酒精棉球擦拭双手，在超净工作台门口处，并将台面擦出与肩同宽的正方形区域，此区域即为操作区域。将用毕的棉球放入烧杯中。

3.物品摆放：将酒精灯放于擦拭区域的中心，将接种环放于酒精灯的右侧，将菌种放于酒精灯的左侧，将无菌平板的包装除去，包装置于操作区外，无菌平板置于酒精灯左侧。

4.点燃酒精灯：打开酒精灯盖，将盖扣于离开操作区的台面上，点燃酒精灯，酒精灯周围3-5cm之内即为无菌区。

5.灼烧接种环：右手持接种环，将接种环的金属丝直立于酒精灯外焰处，灼烧至红透，然后略倾斜接种环，灼烧金属杆，注意灼烧时要将金属丝与金属杆的连接部分充分灼烧。

6.取菌种：左手持斜面的底部，将管口置于火焰的无菌区，右手小指打开试管塞，将接种环的接种丝放于外焰处再次灼烧至红透，然后将其深入试管内部，稍微凉一下，轻轻取一环，勿划破培养基，将接种环从试管中取出，注意取时勿碰触试管壁。将试管塞灼烧一圈，塞于试管上。因试管口一直在火焰的外焰处，故其温度较高，塞试管塞时注意勿烫手。

7.接种：左手取无菌平板一个，用拇指和食指控制皿盖，其余几指控制皿底，打开皿盖，使开口角小于30°，将接种环上的菌种按图示进行划线，一区法要求连续划线，且线的边缘应划至培养皿的内缘，线要紧密但不相连。三区或四区法要求每划完一区，都应灼烧接种环，后一区要求与前一区首尾相连，但不得与其他区域搭在一起。

8.培养：将接种完毕的平板放于28℃恒温培养箱中倒置培养72小时。

9.整理台面：操作完毕后，将实验所需的物品放回原处，并将实验所产生的垃圾清理干净，带出超净台，放于垃圾桶中。

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       南昌大学实验报告

学生姓名：   叶落不晓       学    号： 6002212025    专业班级： 给排水121班         

实验类型：√ 验证□ 综合□ 设计□ 创新  实验日期：20##-12-02～09  实验成绩：           

水处理微生物学实验实验设计：

水体中总大肠菌群的检验

一、实验目的和要求

1．掌握多管发酵法测定水中大肠菌群的技术；

2、通过大肠杆菌群的测定，了解大肠杆菌群的生化特性；

3、学习使用大肠菌群检数表；

3、进一步巩固光学显微镜的使用方法。

二、实验基本原理

总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。多管发酵法的原理是根据大肠菌群能发酵乳糖、产酸、产气，以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过初发酵试验、平板分离和复发酵试验等三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。试验结果以最可能数（Most Probable Number），简称MPN表示。

如果接种的水样量不是10mL、1mL和0.1mL，而是较低或较高的三个浓度的水样量，也可查表求得MPN指数，再经下面公式换算成每100mL的MPN值：

大肠菌群数系指每升水样中所含有的有大肠菌群的数目。大肠菌数一般包括大肠埃希氏杆菌、产气杆菌、枸椽酸杆菌和副大肠杆菌。本实验的发酵试验采用含有乳糖的培养基，测定结果不包括副大肠杆菌。

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脓汁和粪便标本中病原菌的检测

09级 临床心理 113200900140026 方海瑞

v 实验目的

①实验课教学的主要目标是使我们了解医学微生物学主要的研究方法和手段，掌握基本技能和基本原理，树立牢固的无菌观念。

②培养我们自学能力、科学思维能力、动手能力和表达能力。

③掌握检测脓汁和粪便标本中病原菌的基本方法和操作

实验器材

常用设备：隔水式电热恒温培养箱 冷冻室

固定器材：试管架 酒精灯 污物盘 油性笔  打火机 奥林巴斯 CX21型生物显微镜

共用实验台：蒸馏水 1‰新洁而灭 玻片缸 消毒液

微生物器材柜（放微生物实验必备器材和试剂等）

此次实验专用器材：天平，干粉培养基，浓汁标本1支，粪便标本1支，碘酒棉球1瓶，酒精棉球1瓶，眼科镊子2把，伊红美兰平板2个，营养琼脂平板5个，斜面4支，细菌分离培养物（上次实验平板），斜面培养物4支，营养肉汤4支，生理盐水2支，营养肉汤培养物（菌液）4支，半固体琼脂4支，营养琼脂平板4个，糖发酵管1套，抗菌素纸片1套，眼科镊子2把，镜油瓶、拭镜纸1套，吸水纸1本，载玻片4张，半固体培养物4支，药敏试验培养物4个，微量发酵管培养物1套。

v 方法与步骤

培养基的制备干粉培养基  蒸馏水→加热溶化→分装→集中放在试管筐里，然后罩上硫酸纸、牛皮纸，用橡皮筋扎好 →放入讲台边的灭菌桶或灭菌筐内→送到高压蒸汽灭菌室

↓

细菌的分离培养          接种环烧灼灭菌，接种环取液体标本经无菌取材后在平板划线（平板划线分离法）

↓

细菌的纯培养             甲→普通平板→黄色菌落→1支斜面

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微生物技术综合实验

年    级： 13级生物工程（专升本）

班    级：       2013011201       

学    号：       1301014026     

姓    名：       徐  红  贞           

指导老师：      刘凤霞   教授   

日    期：     二零一三十月五号 

目  录

1实验目的及原理………………………………………………………………1

1.1实验目的 ……………………………………………………………………………1

1.2实验原理 ……………………………………………………………………………1

2实验材料………………………………………………………………………1

2.1实验仪器 ……………………………………………………………………………1

2.2实验试剂 ……………………………………………………………………………1

2.3培养基 ………………………………………………………………………………2

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