篇一 :质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告及思考题

1.实验目的:

(1)通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒;

(2)通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术;

2.实验材料及用品

(1)实验仪器(apparatus):

恒温培养箱(Constant temperature incubator)、恒温摇床(Constant temperature shaking table)、高速离心机(High speed centrifuge)、漩涡振荡器(Vortex mixer)、超净工作台(Bechtop)、高压灭菌锅(Autoclave)、微量加样器(Pipettes)、烧杯( beaker)、量筒 (graduated cylinder)、 玻璃棒(stir bar)、 微波炉(microwave)、 天平(Pan balance)、电泳梳子( comb)、电泳槽 (electrophoresis tank)、 电泳器 (Electro-phoresis  System)、 紫外灯(Ultraviolet  transilluminator )

3)、材料与试剂(Reagents):

①溶液I(Solution Ⅰ):

50mmol/L 葡萄糖;25mmol/L  三羟基甲基氨基甲烷(Tris)Tris-HCl(pH8.0);10mmol/L  乙二胺四乙酸(EDTA) pH8.0

溶液I可成批配制,每瓶约100ml,10磅高压蒸气灭菌15分钟,贮存于4℃。

②溶液Ⅱ(Solution Ⅱ):新鲜配制,等体积混合

0.2mol/L  NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释);1%  SDS (可用10%贮存液稀释配制)注意:SDS易产生气泡,不要剧烈搅拌。

③溶液III (Solution Ⅲ,100mL):加上后混匀会形成絮状沉淀

…… …… 余下全文

篇二 :质粒DNA的提取实验报告

质粒DNA的提取

一、实验方法

碱裂解法抽提质粒DNA

二、实验原理

基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。

三、实验步骤

1)质粒提取

1. 10,000g,1min离心收集1.5-5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。

2. 加入100ml溶液1,振荡至彻底悬浮。

3. 加入200ml溶液2,立即轻柔颠倒离心管6次,使菌体充分裂解,随后将离心管冰上放置3分钟

4. 加入150ml溶液3,立即温和颠倒离心管数次,冰上放置3分钟,10,000g离心10min。

5. 将步骤4的上清转移至新的离心管(尽量去除杂质),加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10,000g离心5min。

6. 将步骤5的上清转移至新的离心管,加入2倍体积的无水乙醇,室温放置5-10min,沉降DNA

7. 10,000g离心10分钟,弃乙醇,保留沉淀,加入1ml 70%的乙醇洗涤沉淀, 10,000g离心5分钟

8. 倒掉乙醇溶液,用吸水纸吸净管壁上的水珠,室温蒸发痕量乙醇

9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA

2)质粒鉴定®琼脂糖凝胶电泳

灌胶:胶中加入荧光染料(SYBR Green I)

加样:质粒+上样缓冲液®混匀

电泳

结果观察:UV灯下

四、实验结果

五、实验分析

裂解细胞中除含有质粒DNA外,还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质,因此用碱裂解法除去杂质

1、防止DNA裂解:Solution 1 

 1)、所含糖增加溶液黏度,维持渗透压,防止DNA受机械剪切作用降解

2)、所含EDTA抑制酶活性

2、溶解与变性:Solution2

1)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性

2)离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白

3、沉降与复性:Solution3

1)质粒DNA复性

…… …… 余下全文

篇三 :实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告

实验一、质粒DNA的提取及检测

【实验目的】

1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤

2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术

3、学会PCR操作的基本技术

第一部分 质粒DNA的提取

一、实验原理:

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确,而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会那么迅速而准确,它们缠绕形成网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

二、仪器与试剂

1、仪器 恒温摇床、台式离心机

2、试剂 溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿

三、实验步骤

1、 将2mL含相应抗生素(Amp:50μg/mL)的LB液体培养基加入到试管中,接入含pUC19

质粒的大肠杆菌,37℃振荡培养过夜。

2、 取1.5mL培养物倒入微量离心管中,4000r/min离心2min。

3、 吸去培养液,使细胞沉淀尽可能干燥。

4、 将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中,充分混匀,室温放置10 min。

5、 加200μL溶液Ⅱ(新鲜配制),盖紧管皿,混匀内容物,将离心管放冰上5min。

6、 加入150μL溶液Ⅲ(冰上预冷),盖紧管口,颠倒数次使混匀。冰上放置15min。

7、 12000r/min,离心15min,将上清转至另一离心管中。

8、 向上清中加入等体积酚:氯仿(1:1)(去蛋白),反复混匀,12000r/min,离心5min,

…… …… 余下全文

篇四 :质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告

一、实验名称:质粒DNA的提取与纯化,DNA琼脂糖凝胶电泳

二、实验原理:

1.质粒DNA的提取:

质粒是一类存在于几乎所有细菌等微生物中染色体之外(细胞质中)呈游离状态的双链、闭环的DNA分子,能够自主复制和稳定遗传,以超螺旋形式存在,是最常用的基因克隆载体。除质粒外,大肠杆菌中还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂质等物质,因此需要裂解细胞并除去蛋白质和染色体DNA等物质才能分离纯化出质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多,其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验使用碱裂解法,即利用SolutionⅠ 、Ⅱ、Ⅲ三种溶液分离提取质粒DNA.其原理如下。

(1)碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理:

碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA之间变性与复性的差异来分离质粒DNA,达到分离提纯质粒DNA的目的。在pH值高达12.6的碱性条件下,线性的DNA因氢键断裂,双螺旋结构解开而变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的大部分氢键会被断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链相互缠绕,不会完全分离。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时,共价闭合环状的质粒DNA复性,恢复其天然构象,以可溶状态存在于液相中;而线性的染色体DNA由于两条互补链彼此已完全分开、分子量大、结构复杂而相互缠绕形成不溶性网状结构。与不稳定的大分子RNA、变形的蛋白质以及细菌碎片等一起沉淀而被除去。进一步用酚、氯仿使蛋白质变性去除蛋白质杂质,然后用无水乙醇沉淀,即可获得纯化的质粒DNA。SolutionⅠ 、Ⅱ、Ⅲ三种溶液以及无水乙醇沉淀DNA的具体作用和原理如下。

(2)四种溶液作用及原理:

①Solution I的作用:悬浮大肠杆菌菌体,增加溶液的粘度,维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,在溶液I中加入EDTA,是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉,从而起到抑制DNA酶对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。另外也可保证溶菌酶活性。

…… …… 余下全文

篇五 :11.20 分生实验报告 质粒DNA的提取、纯化与鉴定

实验四  质粒DNA的提取,纯化与鉴定

DNA体外重组技术

【实验原理】

是在分子水平上,根据人们的需要以人工的方法取得感兴趣的目的基因,在体外与载体DNA分子重组,然后将重组分子转入受体细胞,并筛选出能表达重组DNA的活细胞,加以纯化、扩增,成为克隆。

【实验步骤】

1.分离或合成感兴趣的目的基因及载体---分

2.构建、改造作为载体的DNA------------切

3.目的基因与载体DNA在体外重组--------接

4.重组DNA引入受体细胞----------------转

5.阳性重组子的筛选、鉴定、扩增-------筛

【注意事项】

目的基因的获得:

1.从染色体DNA中直接分离

2.人工合成

3.由mRNA逆转录合成cDNA

4.从基因组文库中筛选目的基因

5.PCR获得

载体的选择:

1.能在宿主细胞中独立复制,并能携带重组DNA片段一同扩增;

2.有合适的限制性酶切位点便于进行克隆;

3.有一定的筛选标记,易于识别和筛选;

4.载体分子应尽量小,可插入较大的外源DNA而不影响复制;

5.表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、增强子等调控元件;

6.生物安全性好。

质粒DNA的提取

【实验原理】

     质粒是细胞质中独立于染色体之外的能自主复制的遗传单位。基因工程中的质粒一般是指细菌质粒,它可以随着细菌的细胞分裂将自己的遗传特性稳定的遗传给后代细胞。质粒中除了复制、转录等相关的必需序列外,有一些DNA区段对于细菌来说并非必需序列,通过体外操作以目的基因取代这些非必需区段,这种改造的质粒就成为外源基因载体。按照质粒载体的用途和其外源DNA的遗传信息能否表达可分为中间克隆载体(如pMD18-T)和表达载体(如pET-X、pBI121等)。克隆载体所连接的的DNA片段一般没有启动子,因而不能转录,主要用于目的片段的大量制备。表达载体按照宿主的不同有各种各样的原核表达载体(如大肠杆菌)和真核表达载体(如酵母、动物和植物),目的基因在载体上有完整的启动子和终止子调控,可以在宿主细胞中转录并翻译成蛋白。  根据质粒在宿主细胞中复制调控机制的不同,可分为两类:一类是“松驰型”质粒,如pMB1/colE1复制子,其复制受到一种称为RNAII的分子正向调控,不需要任何质粒编码的蛋白质,完全依赖于宿主提供的寿命较长的酶和蛋白质,因此即使在氨基酸饥饿或添加氯霉素等抗生素抑制蛋白质合成的条件下,其复制仍不停止,;二是“严紧型”质粒,如pSC101,其复制伴随着RepA蛋白的合成,因此一旦蛋白质合成受阻,其拷贝数就不能增加,即在宿主的“严紧”控制下复制。在分子生物学研究中,为了迅速扩增和提取大量的质粒DNA,通常使用的是“松驰型”质粒;但在某些特殊原因(如表达产物对细胞有毒性)下要求用严紧型质粒。

…… …… 余下全文

篇六 :质粒的提取酶切 实验报告

实验一 质粒的提取酶切

实验目的

掌握质粒小量快速提取法。用琼脂糖凝胶电泳法鉴定其纯度。 实验原理

质粒是一种染色体外的稳定遗传因子。大小在1~200kb之间,具有双链闭合环状结构的DNA分子。主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力,能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数,可表达它携带的遗传信息。他可独立游离在细胞质内,也可整合到细菌染色体中,它离开宿主的细胞就不能存活,而它控制的许多生物学功能却赋予宿主细胞的某些表型。

采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)可使细胞壁裂解,经溶菌酶和阴离子去污剂(SDS)处理后,细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上,离心时易被沉淀出来,而质粒DNA则留在上清液中。用酒精沉淀洗涤,可得到质粒DNA。

在细胞内,共价闭环DNA(cccDNA)常以超螺旋形式存在。若两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,这种松弛型的分子叫作开环DNA(ocDNA)。在电泳时,同一质粒如以cccDNA形式存在,它比其开环和线状DNA的泳动速度都快,因此在本实验中,质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。

限制性内切酶是一种工具酶,这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力,能在这个特异性核苷酸序列内,切断DNA的双链,形成一定长度和顺序DNA片段。EcoR I和Bgl II的识别序列和切口是: EcoR I:G↓AATTC

Bgl II: A↓GATCT

G,A等核苷酸表示酶的识别序列,箭头表示酶切口。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口,就能产生多少酶切片段,因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数,就可以推断酶切口的数目,从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知分子量的线状DNA为对照,通过电泳迁移率的比较,就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的分子量。

实验步骤

…… …… 余下全文

篇七 :质粒DNA抽提实验报告

质粒DNA抽提实验报告

一.实验目的

1.掌握碱裂解法小量快速提取质粒DNA的方法,提取的质粒DNA可直接用于酶切,PCR扩增等。

2.学习利用水平式琼脂糖凝脉电泳初步检测DNA的纯度,构型,含量和分子量大小。

二.实验原理:碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DN结果A的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离,当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时,变性的质粒DNA又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

三.实验仪器及试剂:

1.5mlEP管、高速离心机、移液枪

溶液I: 50 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L EDTA、25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)

2毫克/毫升 溶菌酶

溶液II: 200 mmol/L NaOH、1% SDS

溶液III: 3 mol/L NaAc (pH4.8)溶液、TE缓冲液:10 mmol/L Tris-HCl、pH 7.51 mmol/L EDTA

四.实验步骤:

1、取1.5ml细胞培养物于1.5mlEP管中,12000rpm/min离心1min,去上清液(重复一次)

2、加200μl溶液Ⅰ重悬浮细胞

3、加200μl溶液Ⅱ,轻轻摇匀,放置5min

4、加150μl溶液,轻轻摇匀,冰浴5min,12000rpm/min离心5min

5、取上清,加入等体积氯仿,摇匀,12000rpm/min离心10min

6、去上清,加入等体积异丙醇,室温放置5min,12000rpm/min离心10min

…… …… 余下全文

篇八 :质粒DNA测定生化实验报告

南方医科大学

生物化学实验报告

姓    名:  杨晓霞

学    号:  3120040025

专业年级:  2012级口腔

组    别:  第一实验室

生物化学与分子生物学实验教学中心

…… …… 余下全文