动物微生物及免疫学实验报告

一、实验目的

（一）掌握一般培养基的制备原理及要求，掌握培养基酸碱度的测定，熟悉一般培养基的制备过程和各种器皿灭菌方法。

（二）掌握细菌分离培养的基本要领和方法，掌握细菌抹片的制备方法和革兰氏染色法及油镜的使用方法，并认识革兰氏染色的反应特性。

（三）掌握学习用微生物学原理诊断疾病的一般方法及步骤。

二、实验用品

（一）器材

量筒、烧杯、电子天平、漏斗、三角烧瓶、空试剂瓶、玻璃棒、玻璃平皿、刻度吸管、pH试纸、纱布、脱脂棉、天平、电炉、试剂瓶瓶塞、扎绳、放大镜、包装纸、洗耳球、酒精灯、载玻片、火柴、吸水纸、剪刀、记号笔、接种环、注射器、镊子、钳子、毫米尺、培养箱、水浴培养箱、高压蒸汽灭菌锅、油镜

（二）试剂及材料

肘胨、蛋白胨、猪胆盐、氯化钠、琼脂、乳糖、0.01%结晶紫水溶液、0.5%中性红水溶液、血清、胰化蛋白胨、酵母提取物、氢氧化钠、盐酸、牛血清、革兰氏染色液、蒸馏水、小白鼠、病猪内脏

三、实验步骤

（一）培养基的制备

（所有用到的器皿都已121℃高压灭菌15~30min，倾注平板在无菌操作台内完成，并放在无菌操作台内）

1、麦康凯培养基

（1）  组成：蛋白胨17g、肘胨3g、猪胆盐5g、氯化钠5g、琼脂17g、乳糖10g、0.01%结晶紫水溶液10ml、0.5%中性红水溶液5ml、蒸馏水1000ml

（2）  方法：将蛋白胨、肘胨、猪胆盐和氯化钠溶解于400ml蒸馏水中，调节pH至7.2。将琼脂加入600ml蒸馏水中，并加入乳糖，加热熔化。将两液混合，分装于烧瓶内，用纱布、扎绳等捆好后，121℃高压灭菌15~30min。待冷却至50 ~ 55℃ 时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板。

注：结晶紫和中性红水溶液配好后需经高压灭菌。

2、血清平板

（1）  组成：营养琼脂、牛血清

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实验实训九 微生物接种技术

一、 实验实训目的

学习微生物工作的基本接种方法，建立纯培养技术中的“无菌“概念”，掌握无菌操作技术。

二、 实验实训材料

1．菌种 葡萄球菌、大肠杆菌斜面菌种。

2．器材 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（斜面、液体、柱状、平板等），接种环（针），酒精灯，酒精棉球。

三、 实验实训内容及方法

（一） 常用的几种工具（实图9-1）。

（二） 无菌操作

菌种分离或移接工作应在无菌环境中进行，接种室、接种箱或超净工作台是常用的接种环境。用前先清洁好卫生，再进行消毒处理。可用紫外线灯和甲醛熏蒸的双重作用，或用3%来苏尔及其他表面消毒进行喷雾。

操作者的手应先用肥皂洗净，再用酒精棉球消毒；整个操作过程都要靠近酒精灯火焰；接种工具在用前和用后必须在灯焰上灭菌；棉塞不得乱放，操作中只能夹在手上；不能有跑、跳等力度大的动作，以免引起空气大振动而增加染菌机会。

（三）接种方法

1．斜面接种法 把各种培养条件下的菌种，接入斜面上（包括从试管斜面、培养基平板、液体纯培养物等中把菌种移接于斜面培养基上）。这是微生物学中最常用、最基本的技术之一。接种前，需在待接种试管上贴好标签，注明菌名及接种日期。接种最好在无菌室或无菌箱内进行，若无此条件，可在较清洁密闭的室内进行。室内应事先消毒，桌面要清洁，除去灰尘和杂物，用5%来苏儿溶液擦洗桌面。斜面菌种移接的基本操作方法及注意事项见实图（9-2）。

（1）点燃酒精灯，灯焰周围约1～2cm处的空间为无菌区，所以在酒精灯灯焰旁进行无菌操作法接种，可避免杂菌污染。

（2）将菌种及接种用的斜面培养基（即两支斜面试管）同时握在左手中，使中指位于两试管之间。管内斜面向上，两试管管口相互平行，两支试管处于接近水平位置，用右手的小指、无名指及手掌在火焰旁同时拔去两支试管的棉塞，并使管口在火焰上通过，以烧死试管口的杂菌。随后把管口移至火焰近旁约1-2cm处。

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实验十一   IMViC与硫化氢试验

指导教师：##

周六 第三组

一、实验目的

了解IMViC与硫化氢反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方法。

二、实验原理

IMViC是I－吲哚（indol test）、M－甲基红（methyl red test）、V－伏-普（Voges-Prolauer test）和C－柠檬酸盐（citrate test）4个实验的缩写。这4个实验主要用来快速鉴别产气杆菌与大肠杆菌，多用于水的细菌检查。大肠杆菌虽非致病菌，但在饮用水时若超过一定指标，则表示水质受粪便污染。产气杆菌也广泛存在于自然界中，因此检查水是要将两者分开。硫化氢（H2S）实验也是检查肠道细菌的生化实验。

（一）吲哚试验（indol test）

    吲哚试验是用来检测吲哚试验的产生，有些细菌分解培养基中的色氨酸生成吲哚（靛基质），经与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色。

只有部分细菌能产生色氨酸酶，从而具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚实验可以作为一个生化检测指标。大肠杆菌产色氨酸酶实验结果为阳性（红色），产气肠杆菌不产色氨酸酶实验结果为阴性（无色）。

（二）M-甲基红试验（methyl red test）

用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。细菌代谢糖产生酸使培养基变酸（pH下降），使甲基红指示剂变色：橘黄色（pH6.3）红色（pH4.2）

尽管，所有肠道微生物都能发酵葡萄糖产生有机酸，但大肠杆菌和产气肠杆菌有区别：

两者在培养早期产生有机酸，但大肠杆菌在培养后仍能维持酸性pH4，而产气肠杆菌则将有机酸转化为非酸性产物，使pH上升至6左右。因此，大肠杆菌为阳性（红色），产气肠杆菌阴性（黄色）。

（三）伏-普实验（Voges-Prolauer test）

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脓汁和粪便标本中病原菌的检测

专业：  学号： 姓名：

一、实验目的

探究检测其病原菌的类型并通过一系列的观察与鉴定从而确定其病原菌的名称和性质。在实践中学习培养基的制备、消毒和灭菌，细菌的分离与培养，细菌群体和个体形态特征的观察，细菌生化反应鉴定等技巧。从而掌握微生物实验的各种操作方法，培养对微生物实验的兴趣。

二、实验材料

器材 

打火机、油性笔、酒精灯、接种环、接种针、污物盘、普通冰柜、隔水式电热恒温培养箱、奥林巴斯CX21型生物显微镜、电炉、试管（带棉塞）、称量纸、药勺、牛皮纸、硫酸纸、橡皮筋、尺子、锥形瓶、高压蒸汽灭菌器、镊子、玻片、吸水纸、拭镜纸

试剂药品

普通营养琼脂培养基、蒸馏水、脓汁标本、粪便标本、石蜡油、生理盐水、结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、稀释复红、葡萄糖微量发酵管（2支）、乳糖微量发酵管（2支）、青霉素抗菌素纸片、链霉素抗菌素纸片、庆大霉素抗菌素纸片、血浆、福氏志贺菌诊断血清

三、方法与步骤

培养基制备

 

细菌的分离培养

 

细菌纯培养

 

细菌的形态学检查

 

细菌的生化试验

 

细菌的血清学试验、结果分析→实验论文撰写

1、培养基制备

干粉培养基→蒸馏水→加热溶化→分装→集中放在试管筐里→罩上硫酸纸、牛皮纸→ 用橡皮筋扎好 →放入讲台边的灭菌桶或灭菌筐内→送到高压蒸汽灭菌室（洗刷室）→灭菌→

（1）平板培养基：倾注平板10ml→琼脂完全凝固后，平板倒放→4℃冰箱保存备用。

（2）斜面培养基：培养基趁热斜放→琼脂凝固以后，4℃冰箱保存备用。

→贴上标签后灭菌使用。

2、空气与人体体表细菌学检查

①空气的细菌学检查

每组1个营养琼脂平板，选择采样地点（实验室、卫生间或任选地点）→将平板盖打开，盖朝下放置在平板旁边→平板暴露于空气中15min→平板倒扣盖上→作标记→37℃温箱培养24h→观察结果。

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实验四环境中微生物的检测和分离纯化

一、           实验目的

1.       熟悉常用微生物培养基的配置方法。

2.       学习并掌握各种无菌操作技术，并用此技术进行微生物稀释分离、划线分离接种。

3.       用平板划线法和稀释法分离微生物。

4.       认识微生物存在的普遍性，体会无菌操作的重要性。

二、           实验原理

土壤中有数量巨大、种类丰富的微生物，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的是平板分离法。

平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释，使其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品含菌数。

三、           实验器材

土样10g，牛肉膏蛋白胨培养平板20个，未知菌种平板，当天降雪；

平皿，涂棒，接种环，无菌200ul, 1000ul吸头，记号笔，酒精灯，取液器:1000ul 、200ul各一支，培养箱；

0.9% 无菌生理盐水，250ml三角瓶中装99ml生理盐水,每瓶加约20粒玻璃珠，250ml三角瓶中99ml生理盐水,作100倍稀释用。

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霉菌的培养与形态学观察

实验一  真菌培养基的配制与灭菌

实验目的：（1）了解培养基的配置原理和方法，掌握分离培养微生物的有关准备工作。（2）掌握高压灭菌方法及原理

实验原理：（1）培养基的制备原理：

1. 培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。

          2. 从营养角度分析：

?营养：碳源、氮源、能源、生长素、水分和无机盐等；

?适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力；

?一定的氧化还原电位；

?合适的渗透压。

琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固，不容易被微生物污染。但多次反复融化，其凝固性降低。

（2）湿热灭菌原理－高压蒸汽灭菌

                 在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

实验材料与方法

配制培养基所需器材

实验设备：高压蒸汽灭菌器。

实验器材：500ml三角烧瓶、蓝盖瓶、5ml刻度吸管、培养基、天平、砝码、称量纸、药勺、500ml、100ml量筒、牛皮纸、硫酸纸、橡皮筋、铁丝筐、平皿、剪刀等。

培养基等集中放讲台前高压桶内，送到洗刷室统一高压

灭菌条件及注意事项

        高压灭菌条件：121.3℃，15min 。含糖培养基113 ℃，15min 。

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微生物学实验报告

实验一  普通光学显微镜的使用及细菌染色与形态观察

第一部分：显微镜的使用

一、目的要求

1．熟悉普通光学显微镜的构造、油镜的使用原理和显微镜的维护方法。

2．学会正确使用油镜观察细菌的基本形态和特殊构造。

3．了解各种显微镜的主要特征。

二、实验原理

（一）光学显微镜的构造

微生物实验室中最常用的是普通光学显微镜，它的构造可分为机械部分和光学部分。

1、机械部分

普通复式光学显微镜的机械部分通常包括以下几个部分：目镜、镜筒、基座回转器、物镜、载物台、光圈、聚光器、光源、镜臂、细调节器、粗调节器等。

2、光学部分：目镜、物镜、聚光器、光圈、光源。

（二）放大倍数

标本首先经物镜放大，在目镜的焦距平面上形成一个实像，再经过目镜放大成最终的虚像。总的放大倍数是物镜放大倍数与目镜放大倍数的乘积。

物镜的放大倍数愈大，其工作距离（物镜镜头到标本片之间的距离）愈短，这时光圈就要打开得愈大。

显微镜的放大倍数

（三）分辨距离与分辨力

显微镜的性能受物镜的分辨距离或分辨力所限制。分辨距离即透镜所能分辨的两个物点之间的最小距离，分辨距离愈小，透镜的分辨力愈高，物像也就愈清晰。因此常以分辨距离来衡量显微镜的分辨力。

R=0.61λ/N.A

式中：R-----分辨距离；

      λ------作用光的波长；

N.A------数值口径。

一些介质的折射率

三、实验内容

（一） 材料：显微镜，香柏油，擦镜纸。

（二） 方法：

细菌很小，须使用油镜方可观察到。油镜是显微镜上最重要的部件之一，观察时与玻片非常接近，稍不小心即可压碎玻片，更严重的是损坏镜头，故必须极其仔细地学习油镜的使用方法：

1、为使低倍镜取得最适之光源，可将低倍镜头调节到离载物台约1cm的高度，将聚光器提高，光圈完全打开，然后调节电压旋钮至视野最合适。

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