蛋白质浓度的测定

一．试验原理

考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当他与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm。考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感性。

在一定范围内，考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系。故可用于蛋白质浓度的测定。

二．试验设备与试剂

设备：普通离心机，721型分光光度计

试剂：标准蛋白液（100ug/ml）

三．实验材料

新鲜绿豆芽

四．实验内容

1.       标准曲线的制备

取9支干净的试管，按表进行编号并加入试剂。

2.       样品蛋白的测定

（1）       样品蛋白液制备

   准确称取2g新鲜绿豆芽胚轴的部分，研磨成匀浆，离心分离（4000r/min,10min）。取上清液用0.9%nacl定容到10ml。

（2）       含量测定

           另取两只干净的试管，加入样品液0.1ml，0.9mlnacl和考马斯亮蓝染液4.0ml，混匀。室温静置3min，与波长595nm处比色，读取吸光度。

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福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度

一、原理

蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。

二、实验仪器

1.卵清蛋白片

2.7220分光光度计

3.试管

4.移液管

三、实验试剂

1.Folin-酚试剂A：碱性铜溶液

      甲液：取Na2CO32g溶于100ml0.1mol/l氢氧化钠溶液中

      乙液：取CuSO4.5H2O晶体0.5g，溶于1%酒石酸钾100ml中。

临用时按甲：乙=50：1混合使用。

2.Folin-酚试剂B：将100g钨酸钠、25g钼酸钠、700ml蒸馏水、50ml85%磷酸继100ml浓盐酸置于1500ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏10小时，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml及液溴数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。冷却，稀释至1000ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。临用时，用1mol/l的氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸。

3.1mg/mL牛血清蛋白液：称取1g牛血清蛋白片溶于0.9%氯化钠溶液中，并稀释至1000ml

 四、实验步骤

1.标准曲线的绘制

取7支干燥洁净的试管，编号，按下表加入试剂，比色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。

2.样品测定

准确吸取样液0.5ml于干燥的试管中，同样按下表加入试剂，测出光密度值后，对照标准曲线求出样液的蛋白质浓度。

五、实验结果

标准曲线的绘制：

则根据y=5.5072x=0.325得x为0.05901，则样液的浓度为0.5901mg/ml.

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紫外分光光度法测定蛋白质含量

一、实验目的

1.  学习紫外光度法测定蛋白质含量的原理；

2.  掌握紫外分光光度法测蛋白质含量的实验技术。

二、实验原理

1.测蛋白质含量的方法主要有：①测参数法：折射率、相对密度、紫外吸收等；②基于化学反应:定氮法、双缩脲法、Folin―酚试剂法等。本实验采用紫外分光光度法。

2.蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环中含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280nm附近（不同蛋白质略有不同）。在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度服从朗伯―比尔定律。

利用紫外吸收法测蛋白质含量的准确度较差，原因有二：①对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定误差，故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质；②样品中含有的嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。

三、仪器与试剂

TU―1901紫外可见分光光度计、标准蛋白质溶液3.00mg·mL^-1、0.9%NaCl溶液、试样蛋白质溶液。

    10mL比色管、1cm石英比色皿、吸量管。

四、实验步骤

1.绘制吸收曲线

用吸量管吸取2mL3.00mg·mL^-1标准蛋白质溶液于10mL比色管中，用0.9%NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液作参比溶液，在190~400nm间每隔5nm测一次吸光度Abs，记录数据并作图。

2.绘制标准曲线

用吸量管分别吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL3.00mg·mL^-1标准蛋白质溶液于10mL比色管中，用0.9%NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液作参比溶液，在波长280nm处分别测其吸光度，记录数据并作图。

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蛋白质测定方法

——化学报告

蛋白质的检测

              

     由上表可大致了解五种检测蛋白质的方法，下面以实验的形式进行详细阐述：

1　材料与方法

1.1　仪器材料

(1)仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、抽滤泵。

(2)试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、0.12mol/LpH=4. 7醋酸- 醋酸钠缓冲液、乙醇-乙醚等体积混合液、浓H2SO4 、40%氢氧化钠、30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0. 050molPL标准盐酸溶液、硫酸钾- 硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、双缩脲试剂、考马斯亮蓝G- 250试剂。

1.2　实验方法

(1)凯氏定氮法测定蛋白质含量

将待测样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨(消化) ,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。为了加速消化,可以加入CuSO4 作催化剂和加入K2SO4 以提高溶液的沸点,而加入30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用标准盐酸溶液进行滴定,记录,计算出样品含氮量。每个样品做三次重复测定,取平均值。

(2)紫外吸收法测定蛋白质含量

蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。

紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如,

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蛋白质浓度的测定（Folin-酚试剂法）

【实验目的】

熟悉并掌握用Folin-酚法测定蛋白质浓度的方法。

【实验原理】

    蛋白质（或多肽）分子中含有酪氨酸或色氨酸，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比，可通过绘制标准曲线，用比色法测定蛋白质浓度。

【实验试剂】

1.标准酪蛋白200ug/ml

2.Folin-酚乙液（原液与水按1:1比例混合，实验室已准备）

3.Folin-酚甲液（实验室已准备） A液  4%Na2CO3: 0.2%NaOH=1：1

B液  1%CuSO4 : 2%酒石酸钾钠=1：1

                             A：B= 50：1   混匀

4.样品血清（稀释200倍）

【实验步骤】

1.      准备9支干净的试管，按表一顺序加入试剂

表一

2.      各试管中加入5ml Folin-酚甲液，用旋涡摇匀器充分混合均匀，静置水浴（37度）10min。

3.      各试管中加入0.5ml Folin-酚乙液，用旋涡摇匀气充分混合均匀，静置水浴（37度）30min。

4.      使用分光光度计，用640nm波长进行比色。

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蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝染色法

（实验报告）

实验日期：2015年4月28日   实验温度：室温

实验地点：生物化学与遗传学实验室   指导老师：***

班级：2013级生物技术1班   姓名：**   学号：********

I.实验目的

    1.学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法；

    2.熟悉蛋白质含量测定的影响因素。

II.实验原理

    考马斯亮蓝是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的，这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质浓度的方法。

    考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大吸收波长465nm，与蛋白质结合后变为蓝色，最大吸收波长595nm，在一定的蛋白质浓度范围内吸光度与蛋白质含量成正比。

    蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合，反应2min即可到达平衡，复合物在室温下1h内保持稳定。蛋白质—考马斯亮蓝G-250复合物吸光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。

III.实验试剂与仪器

   1.实验试剂

    (1) 100μg/mL标准蛋白质溶液  5mg酪蛋白溶于50mL的0.1mol/L氢氧化钠溶液      。

(2)考马斯亮蓝G-250试剂  50mg考马斯亮蓝G-250溶于25mL的95%乙醇中，加85%的磷酸50mL，蒸馏水定容至500mL。

(3)正常人血浆。

   2.实验器材

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本科学生综合性实验报告

学号              姓名

学院             专业、班级

实验课程名称测定蛋白质含量的三种方法及其比较

教师及职称

开课学期      至学年       学期

            填报时间       年   月    日

云南师范大学教务处编印

一．实验设计方案

二．实验报告

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