实验九?染色体核型分析

【实验目的】

1. 观察测量照片上每条染色体，进行配对排列和剪贴成核型分析图；

2. 掌握染色体组型分析的各种数据指标，学习和掌握核型分析的方法；

3. 正确理解生物的遗传多样性——染色体多样性。

【实验原理】

核型(Karyotype)亦称染色体组型，是指体细胞有丝分裂中期细胞核(或染色体组)的表型，是染色体数目、大小、形态特征的总和。每一个体细胞含有两组同样的染色体，用2n表示。其中与性别直接有关的染色体，即性染色体，可以不成对。每一个配子带有一组染色体，叫做单倍体，用n表示。两性配子结合后，具有两组染色体，成为二倍体的体细胞。在对染色体进行测量计算的基础上，进行分组、排队、配对，并进行形态分析的过程叫核型分析(如图1所示)。将一个染色体组的全部染色体逐条按其长短、形态、类型等特征排列起来的图称为核型图，它代表一个物种的核型模式。核型分析通常包括两方面的内容：⑴ 确定一物种的染色体数目；⑵ 辨析每条染色体的特征。

图1 人类中期细胞染色体核型分析(2n=46)

染色体在复制以后，纵向并列的两个染色单体，通过着丝粒联结在一起。着丝粒在染色体上的位置是固定的。由于着丝粒位置的不同，染色体可分成相等或不相等的两臂，造成中部着丝粒(m)，亚中部着丝粒(sm)、亚端部着丝粒(st)和端部着丝粒(t)等形态不同的染色体(如图2所示)。此外，有的染色体还含有随体或次级缢痕，所有这些染色体的特异性构成一个物种的核型。细胞分裂中期是染色体的形态结构最典型的时期，通过显微镜摄影，将选取伸展良好，形态清晰，有代表性的细胞分裂相进行高倍拍摄放大，得到用于核型分析的照片。

图2 中期染色体形态及结构

1. 分析标准：⑴ 臂比值r(长臂长/短臂长)；⑵ 着丝粒指数i[(短臂长/染色体长)×100%](表1)；⑶ 相对长度：某条染色体长度占一套单倍体染色体长度总和的百分比：相对长度(%)＝(某染色体长度/单套染色体组总长)×100％(植物)；或：相对长度(%)＝[某染色体长度/(单套常染色体+X染色体)的总长]×100％(动物)；⑷ 臂比指数(N.F.值)：把具中部和近中部着丝粒的“V”形染色体计为2个臂，而把具近端和端部着丝粒的“J”或“I”染色体计为1个臂，以此统计核型中总臂数；⑸ 染色体长度比：根据染色体长度比[(最长染色体长/最短染色体长)×100%]。

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实验五：染色体核型分析

〖实验目的和要求〗

     观察分析细胞有丝分裂中期染色体的长短、臂比和随体等形态特征；学习染色体组型分析的基本方法和技能。

〖实验原理〗

染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、型态与功能之间的关系所不可缺少的重要手段。染色体组是指二倍体生物配子中所含的染色体总称，常以“Ｘ”表示。同一物种的同一染色体组内各染色体的形态、结构和连锁群是彼此不同的，但它们却相互协调，共同决定生物性状的发育。
    研究染色体组型的方法，一是靠有丝分裂时染色体的形态特征，另一是靠减数分裂时染色体的形态和特征。本实验着重介绍有丝分裂的染色体组型分析。
    细胞有丝分裂中期是识别染色体个性特征的最佳时期，而染色体组型分析就是进行染色体特征的鉴别和描述，其形态的鉴别主要依据染色体的长度、着丝粒位置、付缢痕的有无和位置、随体的有无、形状和大小等资料进行分析。现分别介绍如下：

 1.染色体长度，同一染色体组内各染色体的长度是不一致的，其绝对长度可在显微镜上测量，或用放大照片测量后换算。由于染色体制片过程中使用的药剂及方法不同，另外供观察的细胞分裂不可能保证同一时期，故染色体的收缩有差异而导致绝对长度在同一物种或个体不同细胞间发生差异，针对这种情况，在分析中常用染色体的相对长度来表示。
    
在染色体长度测量中，对染色体的两条臂要分别测量，一般随体不计入染色体长度内。
  2.着丝粒的位置：每条染色体都有一着丝粒，其位置可因不同染色体而异。由于着丝粒把染色体分为两个染色体臂：长臂和短臂，它们的比率（即臂比）便可确定着丝粒的位置。
  3.付缢痕的有无和位置：有些染色体上除着丝粒，还另有一不着色或缢缩变细的区域称符缢痕。
  4.随体的有无、形状和大小：有些染色体在短臂的末端有一棒状小体称为随体，随体和染色体臂之间常以付缢痕相隔，具随体的染色体称SAT染色体。

〖材料和方法〗

细胞有丝分裂永久制片或其中期染色体图象的放大照片。

〖用具和药品〗

剪刀、直尺、胶水。

〖实验步骤〗

（一）染色体标本的制备

1.制片

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人体外周血淋巴细胞培养、染色体制备及染色体核型分析

09级一班 3组

摘要：细胞培养是指在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。外周血中的小淋巴细胞几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态。体外培养时经一定剂量的植物血凝素（PHA）刺激，T淋巴细胞可转变为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。处于增殖期的培养淋巴细胞经过秋水仙素处理，可停留在分裂中期或早中期，这一时期的染色体形态为棒状结构，是观察分析染色体的最佳时期

一、实验目的

1．学习人体细胞离体培养的方法；

2．掌握制作人染色体标本的方法；

3．观察人类染色体的形态和染色体数目；

4．熟悉染色体核型分析。

二、实验原理

细胞培养是一种程序复杂而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞在体外长期生存，必须模拟体内环境，共给细胞存活所必需的条件。如供给适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖以及有关的生长因子；氧气及适宜的温度；注意调节其外环境的酸碱度（pH）与渗透压；以及为排除细胞代谢产物的危害，保持良好适宜的外环境而进行必需的传代等等。所有这一切条件与操作都要保持在无菌条件下进行。

外周血淋巴细胞是不能增殖的分化细胞群，在体外无菌培养条件下，若于培养基中植物凝集素(PHA)则可刺激处于G。期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，重新获得有丝分裂的能力，经一段时间的培养即可获得大量分裂期细胞以供染色体分析。秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染色体分中期分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形而利于辨认与观察。

染色体标本制备过程中有两个重要环节，其原理是：(1)低渗处理：目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细胞的固定质量及标本质量。(2)固定：目的在于尽快使细胞的结构固定于接近存活的状态，以便作进一步处理，若不固定则可因细胞内蛋白质分解而导致结构变化。染色体研究中常用固定液为甲醇一冰醋酸(3：1)固定液。冰醋酸渗透力强，固定迅速，但易使组织膨胀而甲醇则可使组织收缩，两者混合使用能抵消各自的缺点，得到较好的固定效果。

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【实验项目】染色体核型分析

实验七：染色体核型分析

〖实验目的和要求〗

     观察分析细胞有丝分裂中期染色体的长短、臂比和随体等形态特征；学习染色体组型分析的基本方法和技能。

〖实验原理〗

染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、型态与功能之间的关系所不可缺少的重要手段。染色体组是指二倍体生物配子中所含的染色体总称，常以“Ｘ”表示。同一物种的同一染色体组内各染色体的形态、结构和连锁群是彼此不同的，但它们却相互协调，共同决定生物性状的发育。
    研究染色体组型的方法，一是靠有丝分裂时染色体的形态特征，另一是靠减数分裂时染色体的形态和特征。本实验着重介绍有丝分裂的染色体组型分析。
    细胞有丝分裂中期是识别染色体个性特征的最佳时期，而染色体组型分析就是进行染色体特征的鉴别和描述，其形态的鉴别主要依据染色体的长度、着丝粒位置、付缢痕的有无和位置、随体的有无、形状和大小等资料进行分析。现分别介绍如下：

 1.染色体长度，同一染色体组内各染色体的长度是不一致的，其绝对长度可在显微镜上测量，或用放大照片测量后换算。由于染色体制片过程中使用的药剂及方法不同，另外供观察的细胞分裂不可能保证同一时期，故染色体的收缩有差异而导致绝对长度在同一物种或个体不同细胞间发生差异，针对这种情况，在分析中常用染色体的相对长度来表示。
    
在染色体长度测量中，对染色体的两条臂要分别测量，一般随体不计入染色体长度内。
  2.着丝粒的位置：每条染色体都有一着丝粒，其位置可因不同染色体而异。由于着丝粒把染色体分为两个染色体臂：长臂和短臂，它们的比率（即臂比）便可确定着丝粒的位置。
  3.付缢痕的有无和位置：有些染色体上除着丝粒，还另有一不着色或缢缩变细的区域称符缢痕。
  4.随体的有无、形状和大小：有些染色体在短臂的末端有一棒状小体称为随体，随体和染色体臂之间常以付缢痕相隔，具随体的染色体称SAT染色体。

〖材料和方法〗

细胞有丝分裂永久制片或其中期染色体图象的放大照片。

〖用具和药品〗

剪刀、直尺、胶水。

〖实验步骤〗

（一）染色体标本的制备

1.制片

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一、实验目的
　学习和掌握核型分析的方法。

二、实验原理
核型亦称染色体组型，是指体细胞有丝分裂中期细胞核(或染色体组)的表型。每一个体细胞含有两组同样的染色体，用2n表示。其中与性别直接有关的染色体，即性染色体，可以不成对。每一个配子带有一组染色体，叫做单倍体，用n表示。两性配子结合后，具有两组染色体，成为二倍体的体细胞。如蚕豆的体细胞2n=12，它的配子n=6；玉米的体细胞2n=20，配子n=10；人类体细胞2n=46，配子n=23。
染色体在复制以后，纵向并列的两个染色单体，通过着丝粒联结在一起。着丝粒在染色体上的位置是固定的。由于着丝粒位置的不同，染色体可分成相等或不相等的两臂，造成中间着丝粒，亚中间着丝粒、亚端部着丝粒和端部着丝粒等形态不同的染色体。此外，有的染色体还含有随体或次级缢痕。所有这些染色体的特异性构成一个物种的染色体组型。染色体核型分析是细胞遗传学、染色体工程、现代分类学和进化理论的重要研究手段，也是一种简便的方法。

三、实验材料
　蚕豆或蛙类染色体标本制片10张，或10个分裂中期细胞的染色体照片。

四、实验器具和药品试剂
放大机、显影盆、游标卡尺、测微尺、剪刀、镊子、计算器、座标纸、绘图纸、胶水、3号放大相纸。
米吐尔、无水亚硫酸钠、对苯二酚、硼砂、炭酸钠、溴化钾、大苏打、钾矾。

五、实验方法和步骤
(一)测量 若用染色体制片标本进行直接测量时，必须利用显微镜与测微尺，事先要用台微尺对目微尺的单位长度进行标定后再进行工作, 仅对染色体长度较大的标本适合。一般标本还是先行拍照放大后进行测量，可得较好数据。首先目测照片上每条染色体长度，按长短顺序初步编号，写在每条染色体短臂的一端，同时确定主缢痕的位置，用游标卡尺逐条测量短臂和长臂长度。根据测量的数据，计算染色体的相对长度，臂比及着丝粒指数。

相对长度=（每个染色体的长度/全部染色体长度）×100

臂比（率）=长臂长度/短臂长度

着丝粒指数=（短臂长度/该染色体长度）×100

说明：以上公式每一项所代入的数据，均为求出5个或10个细胞同源染色体的短臂长度、长臂长度和全长的平均值(即5个或10个细胞中编号相同的染色体各项长度分别相加后以5或10除之)。

着丝点位置按臂比值确定：

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实验八  人类染色体核型分析

一、实验原理

在19世纪后半期许多生物学家用显微镜观察到了染色体，1875年Edward Strasburger 描绘了活的植物细胞的有丝分裂，1879年，Walther Flemming随之从两栖类幼体的固定和染色组织中描绘有丝分裂的过程。他创造了今天常用来描述有丝分裂过程的述语，W. Waldeyer将有丝分裂中期可观察到的主要结构命名为染色体，Theodor Boveri和walter S. Sutton在1902年将遗传物质和染色体联系起来。随着细胞学技术的改善，在许多动物和植物细胞内观察和研究了染色体。

尽管如此，人类染色体的研究进展却很慢，因为研究材料不容易得到,还有被应用于植物和动物细胞的技术不能够用于人类，当人类细胞离体培养生长时这些困难就解决了。培养中的分裂细胞能够用碱性的秋水仙素处理, 使染色体不受分裂细胞纺锤体的影响，接着在培养中的细胞暴露在低渗溶液中，这种低渗溶液可以引起细胞膨胀，因此可以单独观察和数出细胞的染色体。

当徐道觉和A.Levan（在1956年）采用这些技术培养人肺胚胎组织细胞时，人类染色体数目被确定为2n=46，在英国，研究生殖巢组织的C.E .Ford不久就确认了这个观察结果，确定人类染色体数目为46的其它研究是以骨髓和皮肤活组织的细胞培养物为基础的，人类染色体的数目有重要意义研究在1959年,那时J. Lejeune和他的合作者将机能失调的唐氏综合症归因于不正常的染色体数目。从此以后，许多主要的生理和精神错乱都与人类染色体的畸变联系起来了。

对人类染色体的研究通常使用血液白细胞，这种血液白细胞能很方便获得、培养，并诱导有丝分裂(实验七)，当一切准备适当，可看见各种各样长度的人类染色体（最长约10um，最短约2um）和不同位置的着丝粒（主要的狭窄区）。

二、实验目的

1. 根据大小，着丝粒位置和随体的有无描述人类染色体的形态。

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大麦染色体相对长度，臂比和类型

一、核型分析主要参数

二、核型图

三、核型公式

    2n=2x=14=5m+2m(SAT）

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