实验七 考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量

一、试验目的

1. 学习分光光度计的原理及操作

1. 学习利用染色方法提高蛋白质消光系数，以提高分光光度法检测灵敏度

二、基本原理

1. 根据物质的吸收光谱进行定性或定量分析的方法称为吸收光谱法或分光光度法 。该法所用的仪器称为分光光度计或吸收光谱仪。该法所使用的光谱范围包括可见光和紫外光，即包括波长在200 - 800 nm之间的光。

1. 分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。 

3.紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外（远紫外）。由于吸收池（又称样品池、比色杯等）和光学元件以及氧气能吸收小于190nm波长的光，因此常规紫外测定集中在近紫外区，即 200nm-400nm。可见光区为400nm -800nm。

4.考马斯亮蓝G250法

原理：考马斯亮蓝G250与蛋白质结合后，其最大吸收波长从465nm改变为595nm,该蛋白－染料复合物吸光系数很高，所以检测灵敏度很高，可以测定1μg /mL的蛋白质，染料和蛋白结合只需要2分钟，颜色在1小时内稳定。操作简便，快速，是常用的蛋白含量测定方法之一。去污剂，粘多糖等严重干扰该方法的测定

三、试剂

1. 标准蛋白质溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白溶液

2. 考马斯亮蓝G250蛋白染色剂：

四、操作步骤

1.标准曲线的绘制： 

 取6只试管，分别加入浓度为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mg/ml的标准蛋白质溶液0.1ml，然后加入5ml考马斯亮蓝试剂，震荡混匀，2分钟后于595nm测定吸光值，以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。

2.样品测定：

 样品液0.1mL , 然后加入5ml考马斯亮蓝试剂，震荡混匀，2分钟后于595nm测定吸光值。从标准曲线中查出相应的浓度。

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  实验名称：蛋白质的定量测定---考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度

【实验原理】

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-燃料结合的原理。考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液时呈茶棕色，最大吸收峰在465nm。当与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰转至595nm，且其光吸收值与蛋白质含量（10~100μg/ml蛋白质浓度）成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。

【实验准备】

一、材料

（1）血清

二、试剂

（1）考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml。

(2)标准蛋白质溶液：结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根基其纯度用0.15mol/L NaCl配置成1.0mg/ml蛋白溶液。

（3）0.9% NaCl溶液。

三、器材

（1）试管和试管架

（2）722型分光光度计

（3）吸量管

（4）移液枪

【实验步骤】

一、制作标准曲线

取6支干燥洁净的试管，编号按下表加入试剂

各管混匀后，静置3min，以0号管为空白管调零，在595nm波长下分别测定各管溶液的吸光度值（A₅₉₅值）。以吸光度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘出标准曲线。

二、血清蛋白质浓度测定

测定方法同上。1mL稀释血清加2.5mL考马斯亮蓝试剂，血清用0.9%NaCl稀释200倍，使其测定值在标准曲线的直线范围内。用上述0号管调零，测出血清的A₅₉₅值。

【实验结果】

（1）       测定数据如下表

以吸光度A₅₉₅值为纵坐标，牛血清白蛋白标准液浓度为横坐标绘制标准曲线。

（2）根据所测血清的值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，乘以稀释倍数，从而计算出血清的蛋白质浓度（mg/ml）

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蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法

[实验目的]

学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量的方法

[实验原理]

[器材与试剂]

器材

722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支

试剂

1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA），配制成1.00mg/ml。

2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。

[实验方法]

标准方法

1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。

2.加完染料20min后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm处测量吸光度A₅₉₅。

3.用标准蛋白浓度（mg/ml）为横坐标，用A₅₉₅为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。根据测得的未知样品的A₅₉₅，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算:

样品蛋白质含量(μg/g鲜重) =

SDS干扰实验

1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。

2.加完染料20min后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm处测量吸光度A₅₉₅。

[实验数据与结果分析]

（一）标准方法的数据和图

表1 考马斯亮蓝标准法实验表格

根据表1，以A₅₉₅为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。

图1 考马斯亮蓝标准法

根据线性拟合公式y=ax+b计算所测溶液的蛋白质的含量。

（二）SDS干扰数据和图

表2 考马斯亮蓝SDS干扰实验表格

根据表2，以A₅₉₅为纵坐标，SDS浓度为横坐标，作图2。

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蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝染色法

（实验报告）

实验日期：2015年4月28日   实验温度：室温

实验地点：生物化学与遗传学实验室   指导老师：***

班级：2013级生物技术1班   姓名：**   学号：********

I.实验目的

    1.学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法；

    2.熟悉蛋白质含量测定的影响因素。

II.实验原理

    考马斯亮蓝是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的，这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质浓度的方法。

    考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大吸收波长465nm，与蛋白质结合后变为蓝色，最大吸收波长595nm，在一定的蛋白质浓度范围内吸光度与蛋白质含量成正比。

    蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合，反应2min即可到达平衡，复合物在室温下1h内保持稳定。蛋白质—考马斯亮蓝G-250复合物吸光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。

III.实验试剂与仪器

   1.实验试剂

    (1) 100μg/mL标准蛋白质溶液  5mg酪蛋白溶于50mL的0.1mol/L氢氧化钠溶液      。

(2)考马斯亮蓝G-250试剂  50mg考马斯亮蓝G-250溶于25mL的95%乙醇中，加85%的磷酸50mL，蒸馏水定容至500mL。

(3)正常人血浆。

   2.实验器材

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考马斯亮蓝法测定苹果组织微量可溶性蛋白含量

摘要 

本实验以苹果果肉为研究对象，采取考马斯亮蓝比色法测定蛋白质的吸光度值，通过对果实可溶性蛋白提取缓冲液、缓冲液浓度、pH值、外源添加物对果肉可溶性蛋白提取效率的影响的研究，优化苹果果实可溶性蛋白含量测定方法，以期优化果实可溶性蛋白测定条件，为客观反映果实可溶性蛋白水平提供一种可行的方法。结果表明：外源添加PVP和EDTA以是苹果可溶性蛋白提取率的主要影响因素。实验最终确定的提取条件为0.1mol/L pH9.0 Tris-HCl提取缓冲液(内含1mmol/L EDTA和1% PVP)。

前言  

果蔬可溶性蛋白质含量(soluble protein content)是一个重要的生理生化指标，也是果蔬品质和营养的重要评价指标之一。许多可溶性蛋白是构成果蔬中酶的重要组成部分，参与果蔬多种生理生化代谢过程的调控，与果蔬的生长发育、成熟衰老，抗病性、抗逆性密切相关。以比活力(unit/mg protein)表示酶活力大小及酶制剂纯度时，可溶性蛋白的测定也是必不可少的。

1实验部分

1.1实验原理

比活力(unit/mg protein)表示酶活力大小及酶制剂纯度，同时采用考马斯亮蓝法测定蛋白质相结合，得到标准曲线。

考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。 在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。该方法标本用量少、灵敏度高、重复性好，是一种较为理想的方法^[7]。但该方法线性范围窄，需要选择适宜的提取缓冲液及缓冲液浓度、pH值、料液比和外源添加物等，以使测定方法有较高的灵敏度，测定值与真值相近。

1.2实验准备

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标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量

一、标准曲线

一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。

二、蛋白质含量测定方法

1、凯氏定氮法

2、双缩脲法

3、Folin-酚试剂法

4、紫外吸收法

5、考马斯亮蓝法

三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作

（一）、试剂：

1、考马斯亮蓝试剂：

考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H₃PO₄，用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H₃PO₄。

2、标准蛋白质溶液：

纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。

（二）、器材：

1、722S型分光光度计使用及原理（）。

2、移液管使用（）。

（三）、标准曲线制作：

1、

2、以A_595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。

1）、利用标准曲线查出回归方程。

2）、用公式计算回归方程。

3）、或用origin作图  ，测出回归线性方程。即A_595nm=a×X(   )+6

一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。

4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。

（四）、蛋白质含量的测定：

样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A_595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。

一般被测样品的A_595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A_595nm值太大，可以稀释后再测A_595nm值，然后再计算。

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实验五 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量

一、实验目的

1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量的原理与方法

2. 熟练分光光度计的使用和操作方法。

二、实验原理

考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，它与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。它在酸性溶液中呈棕红色，最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。考马斯亮蓝G-250—蛋白质复合物呈蓝色，在一定范围内，595nm下光密度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。 考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法，本方法具有操作方便、快速、干扰因素少的特点。

离心机的使用说明： 1.要离心的离心管和管套要称重，重量不等时将水加在管套里。 2．离心管的放置是对角线放置，要求必须对称。 3. 先将离心机转速旋钮恢复到零刻度后，再定时间，定好时间后缓慢旋转转速旋钮，使离心机均匀的提速到预定转速。

分光光度计的使用说明： 1.接通电源开关，预热20min后，再选择须用的单色光波长。 2.放入已加入溶液的比色皿，盖上样品室盖，推动试样架拉手，使对照比色皿（溶液装入4／5高度，置第一格）置于光路上，调节100％透射比按钮，使吸光度值A=0.00。 3.推动试样架拉手，使样品比色皿置于光路上，读出吸光度值。 4.测量完毕，取出比色皿，洗净后置于乙醇溶液中浸泡脱色。 5.电源开关置于“关”，拔下电源插头。

三、试剂与器材：

1. 试剂：

（1）0.9％NaCl：9g NaCl溶解在1L的容量瓶中。

（2）标准蛋白质：称取50mg结晶牛血清蛋白定溶于50ml容量瓶里。

（3）染液：考马斯亮蓝G-250 0.5g，溶于250mL95%乙醇，再加入500mL85％

(W／V)磷酸，保存于棕色瓶中，称为母液。取150 mL然后加蒸馏水定容到1000mL，保存于棕色瓶中，备用。

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