PCR检测实验室操作规范

一、PCR 实验室的设置及管理

1．目的：建立实验室的合理设置和科学管理，防止实验污染，保证检测结果的可靠性。

2．适用范围：本程序适用于分子诊断室的设置、工作流程和日常管理等。

3．负责人：

4．细则：

4．1流感实验室为急传所的专业实验室，从事临床标本的基因扩增检测及相关科研工作等。

4．2 本实验室采用实时荧光定量（定性）PCR 技术作为病毒基因诊断的主要手段，实验室分为三个区：试剂准备区（第一区）、标本处理区（第二区）、扩增分析区（第三区）。每一工作区配备专用的设备、仪器、辅助设施、耗材、清洁用品、办公用品、专用工作服，并有明显的区分标识。标本的接收则在检验科标本接收处进行。

4．3 各工作区专用的仪器设备、办公用品、工作服、实验耗材和清洁用具等，不可混用。

4．4 各工作区配置、功能和内务管理见各相关SOP 文件。

4．5 严格遵守从“试剂准备区→标本处理区→扩增分析区”的单一流向制度，不得逆向进入前一工作区。

4．6 非本实验室工作人员，未经许可不得入内；进修、实习或其他科室人员因科研活动需要，进入实验区域（试剂准备区、标本处理区、扩增分析区） 需首先熟悉本程序的各项规定并严格遵守执行，在本实验室人员监督指导下进行。

4．7 实验完毕后做好清洁消毒工作。

二、PCR 实验室工作制度

1．目的 ：保持良好的工作环境，以确保检测结果的可靠性，防止交叉污染，防止差错、事故及纠纷的发生。

2．适用范围：所有本实验室人员。

3．负责人：

4．细则：

4．1 本实验室进行临床基因扩增检测及相关实验工作，不得进行其它实验操作。

4．2 各区的用品不得混用。

4．3 在各区的实验操作过程中，操作者必须戴手套和帽子，严格按照操作规程。

4．4 试剂准备区只能进行试剂的贮存及配制等相关操作（见相关SOP 文件）。

4．5 标本处理区只能进行临床标本的保存，核酸提取、保存及其加入至扩增反应管和测定RNA 时cDNA 的合成（见相关SOP 文件）。

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报 批 细 节

1、技术档案：

技术人员简历表、培训档案、要求有实质性文件如每人的学历证书、上岗证、科研成果（课题）、技术文章、获奖证书等的复印件

2、仪器档案：

实验室所有仪器的购买、使用、校正、放置地点、出厂编号、说明书复印件等

实验室所有仪器维护校正记录如：加样器、温度计、温湿度计需出具计量局校正报告文件（可每种只校正一套作为标准）。

扩增仪需有仪器厂家专业技术人员维护校正报告，和校正后的参数。 加样器的出厂编号、使用时间、校正记录。

5700维护后验证记录—用同一公司或校准试剂或用自制质控血清并记录数值

3、其他细节:

垃圾处理：按生物污染性制品，交医院统一处理。

仪器简单操作流程

标记笔、枪头盒等一些小物品都要标明分区。

仪器的申请、采购、使用、验证程序

样本采集（针对临床医护人员）、运输、收集程序

样品的唯一编号原则—应区分开不同天、不同种类的标本

标本的保存程序—包括处理前、刚处理后、报告发放后的原始标本（原则上至少保留一周）应有专人负责。

检测结果的保存、备份记录、质控记录保存，除电脑记录外应有相应的手抄记录（类似于基因日检测统计表类型的）。

抱怨记录—应有时间、事件（项目）、接待人、处理方法、处理结果、处理人签字确认

注 意 事 项

1、回答任何问题都应与自己写的SOP文件相一致."写你所做的,做你所写的".

2、SOP文件不能写的太虚,无法做到的东西不要写,比如公司版的SOP文件里的加样器的校准一般实验室就做不到.模棱两可也不要写,比如"消毒时间一到两小时"不能这样写,多少就是多少.

3、处理标本要在生物安全柜内,而加样则在柜外.

4、各区门口要贴有各区的工作制度,限入标志.还要准备两个登记本,一个来记录紫外消毒,一个来记录工作人员出入.区内还要有一个工作记录本,用来记录各区每天的工作内容,便于监测每天的工作全过程.

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Realtime PCR 检测技术

一、 实验用品：

【实验耗材】

1、移液枪：1mL、100μL、10μL。酒精擦拭，头部重点，紫外线照射。

2、吸头：1mL、100μL、10μL

3、EP管：1.5mL、100μL

4、铝制饭盒

【实验仪器】

天平、振荡器、高速离心机、0.5～10uL、10～200uL、100～1000uL加样器。

【自备试剂】

DEPC(焦碳酸二乙酯)，二甲苯，无水乙醇，0.1％DEPC－H2O。

实验准备：

【器具处理与准备】

先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，小枪头需打入DEPC水，室温过夜，高压，烤干备用。

二、 样品的miRNA抽提

样品中miRNA抽提参照QIAGEN说明书（miRNeasy FFPE Handbook）

三、 RT (All-One miRNA qRT-PCR Reagent Kits，广州复能基因)

1、按下列组份配制RT反应液

5×PAP/RT Buffer 5 μL

RTase Mix 1μL

2.5U/ul Poly A Polymerase 1μL

Total RNA 18μL

Total Up to 25μL

2、反转录反应条件如下: 37℃ 60 min，85℃ 5 min。

3、反应结束后，将其放在冰上待用或-20℃保存。

四、 qPCR (All-One miRNA qRT-PCR Reagent Kits，广州复能基因)

1、按下列组份分别配制Realtime PCR反应体系，以下是每一孔20μL 。

2×All-in-One qPCR Mix 10μL

All-in-One miRNA qPCR Primer(2μM) 2μL

Universal Adaptor PCR Primer(2μM) 2μL

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建立PCR实验室的基本条件

临床基因扩增实验室采用PCR技术用于临床基因诊断，由于PCR技术对所检测的核酸模板进行大量扩增，容易出现实验室污染导致临床检测标本假阳性结果；另外由于PCR技术要求高、影响因素多（特别是RNA标本），实验过程处理不当易导致核酸模板无扩增现象，导致临床标本假阴性结果。因此临床基因扩增检验实验室技术验收和规范化管理是PCR技术本身需要，也是在临床上顺利应用该技术前提。 二、PCR实验室验收准备工作

（一）   硬件准备——实验室基本建设

1.         根据文件要求，临床基因扩增检验实验室原则上分为四个单独的工作区域：试剂贮存和准备区；标本制备区；扩增反应混合物配制和扩增区；扩增产物分析区，如使用全自动封闭分析仪器检测，此区域可不设。

2.         各工作区域必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。

3.         进入各工作区域必须严格按照单一流向进行，即试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物配制和扩增区→扩增产物分析区。

4.         不同的工作区域使用不同的工作服（不同的颜色）。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。

5.         工作区域仪器设备配置标准

n  试剂贮存和准备区 2～8℃和-15℃冰箱：混匀器；微量加样器（覆盖1～1000μl）；移动紫外灯（近工作台面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）；专用工作服和工作鞋；专用办公用品等。

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一、申请临床基因扩增实验实验收的目的

临床基因扩增实验室近年来在我国发展很快，基因诊断技术在疾病的预防、诊断、治疗方面起到了积极的作用。由于、基因扩增检测技术的应用对、实验室的环境条件、仪器设备、试剂耗材、人员技术能力和质量控制等方面要求严格，而一些实验人员对此不甚了解，加之利益的驱使，曾经在20世纪80年代，某些沿海省份的实验室未按要求规范设置，出现气溶胶污染，导致大规模假阳性结果报出，为临床诊断造成了极大的困难。临床基因扩增实验室为了规范实验室，保证基因扩增技术有效应用，防止假阴性、假阳性结果的报出，为临床出具合格而可靠的报告，申请临床基因扩增实验室的验收是必然而且也是必要的。

二、开展临床基因扩增实验的必备条件

根据卫生部20##年1月14日发布了卫医发[2002]10号《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（以下简称《办法》）及其附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》，及同年2月20日卫生部临床检验中心发布《临床基因扩增实验室工作规范》，明确规定临床基因扩增检验实验室开展PCR技术必需具备的条件：

（1）二级以上医院实验室，经卫生部临床检验中心验收合格；

（2）从事基因扩增实验操作的人员必须经过培训并取得上岗证；

（3）使用经国家药品监督管理局批准的允许进入市场销售的商品试剂盒；

（4）开展卫生部允许开展的项目。具备了以上几条后，我们从事临床基因检测任务才是符合要求和规定并对临床出具的报告有保障的。

三、临床基因扩增实验室验收准备工作

1.硬件准备

（1）实验室整体布局：

根据《办法》要求，临床基因扩增检验室原则上分为四个单独的工作区域：试剂贮存和准备区，标本制备区，扩增产物分析区。由于我实验室使用的是罗氏公司的Lightcycler实时荧光定量扩增仪，扩赠后产物不需开盖处理直接检测，所以扩增区和扩增产物分析区合为一室，此区为负压。实验室设计时按照《办法》规定，三个区域相互独立，并有各自的缓冲区域（见图1）

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目 录

文件名称：

管理文件 页码：

1. PCR实验室设置及管理 ??????????????????????5

2. PCR实验室人员配置及管理 ????????????????????7

3. 实验人员的培训程序 ???????????????????????8

4. 仪器设备的管理程序 ???????????????????????9 clin-lab.com

5.实验室内务管理及清洁制度 ????????????????????10

6. 检验报告单管理程序???????????????????????11

7. 试剂准备区的配置、功能、管理文件????????????????12

8. 标本制备区的配置、功能、管理文件????????????????13

9. 扩增及产物分析区的配置、功能、管理文件?????????????14

附件： 1：临床基因扩增实验室规章制度

2：试剂准备区工作制度

3：标本制备区工作制度

4：扩增分析区工作制度

标准操作、程序文件

10. SLAN荧光定量扩增仪使用、维护和校准程序????????????15

11.离心机使用与维护标准操作程序??????????????????19

12.超净工作台使用与维护标准操作程序????????????????21

13.生物安全柜的使用与维护标准操作程序???????????????22

14.旋涡振荡器使用与维护标准操作程序????????????????23

15.加样器使用与维护标准操作程序??????????????????24

16.加样器校准标准操作程序?????????????????????28

17.冰箱使用与维护标准操作程序????????????????? 29

clin-lab.com

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         PCR实验室开展可行性分析报告

一、   开展条件：

1、场所：

实验室分四个分区已建好（试剂准备区、样本处理区、基因扩增区、测序区）。

2、人员：

本科室已有PCR国家资质证书人员两名。

3、检测设备：

待购。

二、可开展项目：

1、实时荧光PCR检测开展的项目

   

2.焦磷酸测序可开展项目

三、实验室布局

    依据：卫生部颁发的《临床基因 扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号）及《医疗机构临床基因扩增管理法》(卫办医政发〔2010〕194号)常见布局请见下图。

四、市场预测：

    1.目前标本量：

        目前每天有10-15例HBV-DNA检测， HCV-RNA 0-2例，HBV P区耐药基因测序0-1例，其他项目有待宣传开发。

2.可开发潜力：

（1）PCR由于需较多手工操作，且操作流程多，对环境要求高，检测难度大导致很多小型医院无力开展，县城周边医院以及乡镇医院一般不会开展，社会效益显著，市场开发空间很大。

    （2）由于医疗技术的发展，开展PCR及测序病人会逐年增加，已经越来越受到重视。

五、可行性分析结论：

综上所述，我院检验科已具备相应标本数量开展PCR，各项配置基本成熟，开展PCR项目可行。

检验科

20##-6-19

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