实验二 聚合酶链式反应(PCR)
一、 实验原理
聚合酶链式反应(PCR)是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物,在体外快速扩增特异DNA片段的技术。它应用热稳定的聚合酶,通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环,DNA片段以指数方式增加了百万倍。从非常微量的DNA甚至单个细胞所含有的DNA起始,可产生ug量的PCR产物。
二、 器材与试剂
1.器材:移液器,EP管,热盖PCR仪,电泳仪,量筒,锥形瓶,微波炉,电子天平,紫外照色仪
2.试剂:引物,模板,Taq DNA聚合酶,原料(dNTPs),缓冲液与Mg2+,H2O, 2*PCRmix溶液,DNA染料
三、 实验步骤
PCR反应体系的建立
取离心管,依次加入试剂混匀
1.H2O 12μl
2.模板 1μl
3.引物T7 1μl
4.引物 sp6 1μl
5.2*PCRmix 15μl
PCR仪的热循环反应
把离心管放入PCR仪中,由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成
1. 模板DNA的变性:模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
2. 模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至56℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
3. 引物的延伸:经加热至72℃左右DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复该循环30次,每次需要2-3分钟。
电泳检测结果
扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中,电泳结束后,放到紫外照射仪中进行透射,电泳明胶显示清晰的条带,如下图所示 加入的为1号样,出现在500bp左右条带,而预算结果为扩增出492bp条带,故实验成功。
…… …… 余下全文