实验三聚合酶链式反应（PCR）以及琼脂糖凝胶电泳

实验目的

1.掌握PCR反应的原理及各反应成分的作用；

2.熟悉PCR反应程序的设计规则；

3.掌握引物的设计原则及其与PCR其他成分的配制方法；

4.掌握琼脂糖凝胶电泳的原理及其应用范围；

5.熟悉琼脂糖凝胶电泳相关缓冲液的配制方法。

实验原理

一．聚合酶链式反应原理

在已知待扩增模板全部或部分序列的情况下，依据DNA半保留复制的机理，在含有Mg2+的缓冲溶液中，采用耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在特异性引物（分为上游和下游引物）的引导下，通过dNTP为原料，以cDNA或DNA等为模板，在人为控制DNA合成系统（PCR仪）温度调节下，通过变性（95℃）、退火（50-60℃ ）及延伸（ 72℃ ）等3个步骤的循环进行（30-35循环），在体外进行双链DNA变性为单链，单链DNA与特异性引物退火形成局部双链，进而在DNA聚合酶的作用下使引物沿相应模板延伸为特异性引物所限定范围的大量双链DNA的体外合成反应。

本质为体外DNA合成的酶反应。

二．琼脂糖凝胶电泳反应原理

    琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。在一定电场强度下偏碱性的缓冲液中（TAE pH8.0或TBE pH7.5-7.8），DNA分子带负电，其迁移速度取决于分子筛效应，在电荷效应与分子筛效应作用下，具有不同的相对分子量及构型的DNA片段泳动速度不同。DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。

    凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可以分离分子量相同，但构型不同的DNA分子。如质粒的三种构型的泳动速率不同：超螺旋闭合环状质粒最快，线型质粒其次，开环质粒最慢。

实验步骤

（一）PCR 加样术式 

…… …… 余下全文

华中农业大学

毕业论文（设计）

聚合酶链式反应技术及其应用

学生姓名：梅慧玲

指导老师：李绪友

所在系部：林业与生态学院 专 业：生物工程

二零一三年四月

目录

摘要………………………………………………………………………1 关键词……………………………………………………………………1

1PCR概述…………………………………………………………..…..1

1.1PCR定义…………………………………………………..……...1

1.2PCR类型…………………………………………………..……...2

1.3PCR技术的基本原理……………………………….………..…..3 2PCR技术的特点……………………………………………….………4

2.1特异性强………………………………………..………………..4

2.2灵敏度高…………………………………….…………,………..5

2.3简便、 快速………………………………………………………5

2.4对标本的纯度要求低…………………………………..………..5

3PCR技术的应用………………………………………………...….....6

3.1PCR在目的基因制备中的应用…………………………….…..6

3.2PCR临床医学中的应用…………………………………....…...6

3.2.1遗传病的基因分析……………………………………,…...7

3.2.2肿瘤的诊断及转移确定……………………………………7

3.3PCR在古生物学中的应用……………………………………...8

3.4PCR在生态学研究中的应用……………………………….…..8

4结语...............................................................................................8

…… …… 余下全文

         普通生物学实验报告

实验名称：用PCR扩增的方法鉴别不同物种来源的肌肉

一、特异性目的片段DNA的扩增

（一）实验原理

    聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，其基本原理为DNA的半保留复制。PCR技术由①高温变性模板 ；②引物与模板退火；③引物沿模板延伸这3步反应组成一个循环，通过多次循环反应，目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将模板DNA置于高温下（通常为93℃-94℃），使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因的两条单链互补结合；热稳定DNA聚合酶（Taq酶)在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板按5’→  3’的方向延伸，合成互补链。

本实验采用物种特异性引物扩增的方法来鉴定3种不同物种来源的肌肉。以不同物种来源的动物DNA为模板，用物种特异性的引物进行PCR扩增，只有在模板和引物的物种相对应的情况下才会有特异性条带的出现。应用此方法，可以特异性地检测样品中痕量的特定DNA成分。

（二）实验步骤

1.不同反应体系的配制

按下表将各成分分别加入一做好标记的无菌PCR管中，配制50μl的PCR反应体系，注意酶要最后加，加完后将PCR管放置在冰上。

2.将上述混合液稍加离心，约10s左右。取下后立即置于PCR仪中，盖紧热盖，定好PCR仪的反应程序，执行扩增程序。

反应程序为：

            预变性    94℃    5min

…… …… 余下全文

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)

coolautumn

DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于19xx年发现 ，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称 Taq polymerase), 则是于19xx年从 温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的 酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于19xx年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于19xx年与 Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了19xx年诺贝尔化学奖。

［PCR原理］

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。

…… …… 余下全文

实验三 PCR扩增

姓名：*** 专业：环境工程 学号：*** 同组人姓名：***

一、实验目的

复习PCR扩增的原理，熟悉PCR的操作流程。

二、实验原理

PCR，即聚合酶链式反应，是一项在体外、短时间内大量扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。以单链DNA为模板、4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸。多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。

PCR包括三个过程：

（1）、变性：目的双链DNA片段在94℃下解链；

（2）、退火：两种寡核苷酸引物在适当温度(50~60℃)下与模板上的目的序列通过氢键配对；

（3）、延伸：DNA模板—引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2-3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

三、实验仪器及材料

PCR扩增仪，微量移液器（0.1~2.5μL、0.5~10μL、10~100μL三种），Tip头，0.2ml薄壁管，1.5ml离心管，Taq DNA 聚合酶，dNTP，buffer，引物（341FGC和534r），16S全长DNA样本。

四、实验步骤

1、用微量移液器分别取194μLddH2O、25μL Buffe、10μL dNTP、5μL 341FGC引物、5μL 534r引物及12.5μL Taq DNA聚合酶于1.5ml离心管中，混合均匀后分装到9个0.2ml薄壁管中，每支管加入24μL混合液。

…… …… 余下全文

PCR基因扩增

实验目的：通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。

实验原理：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2的n次方倍。

实验仪器：基因扩增仪 移液器

实验试剂：

 10×PCR缓冲液(含Mg2＋) 

 4种dNTP   

 Taq酶

DNA模板

两种引物（正向引物和反向引物） 

实验步骤:`

1、按顺序向微量离心管中依次加入：

ddH2O 20μl

 DNA 样品5μl

 10×PCR 缓冲液5μl

dNTP 4μl

 引物I 5μl

 引物Ⅱ 5μl

 混匀。

2、PCR反应参数

 (1) 94℃变性2min

 (2) 94℃变性30sec，

 (3) 66℃退火30sec，

 (4) 72 ℃延伸1min。

 (5) 重复(2)-(4)40次

 （6）72 ℃延伸7min。

 （7）4℃保存

3、琼脂糖凝胶电泳检测PCR的结果：取10μl PCR扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测。保持电流40mA。电泳结束后，用EB染色15min，紫外灯下观察结果。

实验结果：照片结果图

 

1.10ul样品

2.样品

3.DNA相对分子质量标准

4.对照

DNA琼脂糖凝胶电泳

实验目的：通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。

实验原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA在碱性的溶液中带有负电荷，因此，在电场作用下朝正极移动。在琼脂糖凝胶中电泳时，由于琼脂糖凝胶具有一定孔径，长度不同的DNA分子由于所受凝胶的阻遏作用大小不一，迁移的速度不同，从而可以按照分子量大小得到有效分离。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中。在紫外光的照射下，插入溴化乙锭的DNA呈橙红色荧光，所以溴化乙锭可以作荧光指示剂指示DNA含量和位置。

…… …… 余下全文

华中科技大学生命科学与技术学院

分子生物学实验报告

专业 班级 姓名 学号 日期 成绩

实验一 质粒的小剂量提取——碱裂解法

实验原理：

质粒(Plasmid)是独立于细菌染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子，是一种环状的双链DNA分子，大小为1-200千碱基对(kb)，存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多，在细胞中一般以游离超螺旋状存在。质粒具有自主复制性、不相容性、多拷 贝性、转移性、选择性遗传标记、质粒DNA链上有1到几个限制性内切酶单一识别位点等特点。它可独立游离于细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA库和次级克隆。

质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“严谨型”；二是“松驰型”。

1.严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；

2.松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。

质粒的提取有多种方法。本实验采用碱裂解法 进行质粒的小量制备。碱裂解法是常用的质粒的小剂量提取法，它的原理是：在碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA都发生变性，但质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当用酸性的高盐缓冲液将pH中和至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型并溶解在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，缠结的染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质—SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。上清液中的质粒DNA因不溶于70％的乙醇，可在加入乙醇后通过离心得到质粒DNA沉淀

…… …… 余下全文