实验五  酶促反应动力学实验

                                        ——温度和离子对酶活性的影响

【实验目的】

1、了解温度对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。

2、了解离子对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。

【实验原理】

1、每种酶都有其最适温度，高于或低于此温度酶的活性都降低。一般而言，若酶处于过高的温度环境中，会使酶活性永久丧失；而若处于极低温度的环境中只会使酶活性受到抑制，一旦温度适宜，酶又会全部或部分的恢复其活性。

2、酶的活性常常受某些物质的影响，有些物质能使酶的活性增加，称为酶的激活剂；有些物质能使酶的活性降低，称为酶的抑制剂。Cl^-是唾液淀粉酶的激活剂。其它的阴离子，如Br^-、NO₃^-和I^- 对该酶也有激活作用，但较微弱。而Cu²⁺对唾液淀粉酶具有抑制作用。激活剂和抑制剂影响酶活性的剂量是很少的，并且常具有特异性。

就本实验，低浓度CI^-可以增加酶活性，高浓度的CI^-或者低浓度的Cu²⁺则会抑制酶活性，同时低浓度的Na⁺、SO₄^2-等对酶活性没有影响。激活剂的作用机制是多种多样的，可能是作为辅酶或辅基的一个组成部分，也可以直接作为酶活性中心的构成部分。

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“蛋白酶凝乳特性研究”     

1.实验目的

通过研究胃蛋白酶、木瓜蛋白酶作用于脱脂乳的最适凝乳温度、最适pH值、以及金属离子对酶凝乳效果的影响，使学生掌握酶学研究的基本方法，从而掌握生物化工研究的一些基本理论和主要思路，为科研开发打下必要的基础。

2.实验原理

    胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等具有很强的蛋白质催化特性，又具有良好的凝乳特性。因脱脂乳含大量酪蛋白，木瓜蛋白酶的凝乳特性主要表现为随机切割精氨酶-苯丙氨酸的肽键，达到破坏蛋白质稳定的效果，进而发生凝乳。奶酪的生产以前主要利用牛凝乳酶达到凝乳效果，但牛凝乳酶主要是从小牛的第四胃中提取得来，其来源受到极大的限制，通过研究蛋白酶、木瓜蛋白酶的凝乳特性并对其进行优化，一定程度地缓解凝乳酶来源的紧缺状态。

3.实验材料、仪器和试剂

3.1实验材料       优质脱脂乳

3.2实验药品和器皿

3.3试剂

（1）配制浓度为100g/L的脱脂乳1000ml,混匀后待用。（5组）

（2）配制浓度为10g/L的木瓜蛋白酶液和浓度为2g/L胃蛋白酶溶液各500ml，混匀后待用。（5组）

（3）配制0.1mol/L NaOH和0.1mol/L的HCl溶液各1000ml,用于调节溶液pH值。（5组）

4.操作步骤

4.1木瓜蛋白酶（胃蛋白酶）凝乳活力的测定　

取 5mL100g.L^-1的脱脂乳,在65℃下保温5min,加入0.5mL10g.L^-1的木瓜蛋白酶液（或胃蛋白酶液）,迅速混合均匀,准确记录从加入酶液到乳液凝固的时间(s)。把40min凝固1mL100g.L^-1的脱脂乳的酶量定义为一个索氏单位(Soxhletunit),并以相对活性(RU)表示各因素的影响效果。SU=（2400/T）×（5 / 0.5）。式中:T为凝乳时间(s)

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酶促反应动力学综合实验

实验（一）——碱性磷酸酶Km值的测定

【目的要求】

1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响

2.了解米氏方程、Km值的物理意义及双倒数作图求Km的方法。

【实验原理】

1、碱性磷酸酶：

碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多其次为肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。本实验用的碱性磷酸酶是从大肠杆菌中提取。

2、米氏方程：

Michaelis-Menten 在研究底物浓度与酶促反应速度的定量关系，导出了酶促反应动力学的基本公式，即：

                            (1)

式中：v表示酶促反应速度，

      表示酶促反应最大速度，

      [S]表示底物浓度，

      表示米氏常数。

3、  值的测定主要采用图解法，有以下四种：

    ①双曲线作图法（图1-1，a）

根据公式（1），以v对[s]作图，此时1/2时的底物浓度[s]值即为Km值，以克分子浓度（M）表示。这种方法实际上很少采用，因为在实验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和。实测一个近似值，因而1/2不精确。此外由于v对[S]的关系呈双曲线，实验数据要求较多，且不易绘制。

    ② Lineweaver- Burk作图法双倒数作图法（图1-1，b）

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酶促反应动力学实验的设计

【实验目的】

酶促反应动力学研究酶促反应的速度以及影响酶促反应速度的各种因素。影响酶促反应的因素主要包括酶浓度、底物浓度、温度、pH、抑制剂和激活剂。本实验的目的即是通过设计一定的实验方案，以分析研究各种因素对酶促反应速度的影响。各实验小组可在以下实验项目中选择一项，通过检索参考文献资料，组织课堂讨论，设计完成实验方案，并通过具体实验操作以检验实验方案的可行性和正确性。

（一)温度对唾液淀粉酶活性的影响

【实验原理】

酶作为生物催化剂与一般催化剂一样呈现温度效应，酶促反应开始时，反应速度随温度升高而增快，达到最大反应速度时的温度称为某种酶的最适温度。由于绝大多数酶是有活性的蛋白质，当达到最适温度后，继续升高温度，引起蛋白质变性，酶促反应速度反而逐步下降，以至完全停止。

酶的最适温度不是一个常数，它与作用时间长短有关。测定酶活性均在酶促反应最适温度下进行。常用恒温水浴保持温度恒定。大多数动物来源的酶最适温度为37~40℃。 本设计性实验以人唾液淀粉酶为例，观察高温（沸水浴)、最适温度（37℃水浴)和低温（冰水浴)环境对酶活性的影响，并根据底物即淀粉水解的快慢来判断酶活性的高低。 淀粉经淀粉酶催化水解为葡萄糖的不同阶段，与碘试剂作用的颜色反应如下：淀粉（蓝色)→紫色糊精（紫色)→红色糊精（红色)→无色糊精（不显色)→麦芽糖（不显色)→葡萄糖（不显色)。

【实验试剂和器材】

1. 试剂

⑴ 1/15 mol/LpH6.8磷酸盐缓冲液（phosphate-bufferedsaline，PBS)：称取NaH2PO4·2H2O10.4 g，溶于1000 mL蒸馏水中，即为1/15 mol/L NaH2PO4液。称取Na2HPO4·12H2O23.88 g，溶于1000 mL蒸馏水中，即为1/15 mol/L Na2HPO4液。

取1/15mol/LNaH2PO4液51 mL，加1/15 mol/L Na2HPO4液49 mL，混匀，即为1/15 mol/L pH 6.8磷酸盐缓冲液。

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本科学生实验报告[n1] 

学号    104120440   姓名      孙永升      

学院  生命科学学院   专业、班级  10生物技术    

实验课程名称      酶  工  程  < 实验 >      

教师及职称       李俊俊    < 讲师 >      

         开课学期  20##  至   2013  学年   第二学期   

         填报时间    20##   年    5     月    8     日

                                     云南师范大学教务处编印

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第三章 复习题

3．答：①Lineweaver-Burk法：米氏方程可变形为，以作图，将得一直线，直线截距为，斜率为，据此计算。此法由于采用两个独立变量和，底物浓度很低时，反应速率也很低，取倒数，误差较大。

②HanesWoolf法：米氏方程可变形为，以作图，将得一直线，直线截距为，斜率为，据此计算。此法在底物浓度很低时误差较小。

③EadieHofstee法：米氏方程可变形为，以作图，将得一直线，直线截距为，斜率为，据此计算。

上述方法的共同点，是要从动力学实验中获取不同的CS值和r值。而r不能由试验直接取得，试验中能直接得到的是不同时间t时的浓度CS值（或CP值）。为此需要根据速率的定义式，在CS～t的关系曲线上求取相应各点切线的斜率，才能确定不同时间的反应速率r。这种求取动力学参数的方法又称之为微分法。显然，用这种微分法作图求取反应速率会带来较大的误差。

④积分法。

米氏方程积分后可变形为

以作图，将得一直线，直线斜率为，截距为。因此直接采用动力学实验中测得的时间t、底物浓度CS数据作图，即可求取动力学参数值。

6．解：酶催化水解反应机制为

   

采用稳态法推导反应动力学方程：

解之，得

式中，，

7．答：（1）酶的稳定性受温度和时间的双重影响，其函数表达式为

图2－11清楚地表明了温度和时间对酶稳定性的双重影响。在同一温度下，不同的保温时间残存酶活力有极大差异。

图（a）中不同温度下保温10min后残余酶活力曲线只表明，在保温时间为10min时，酶在50°C以下是稳定的，而并不能得出“酶在50°C以下是稳定的”这一结论。因为不同的保温时间必将对酶的稳定性产生影响。

（2）一定的酶促反应都是由正向的酶促反应与酶的失活反应的复合。当时间一定，随温度的升高，反应速率增大，转化率提高，但当温度高于某一值时，由于酶的热失活速率加快，当快于酶促反应速率上升的速度时，酶的总反应速率下降，最终降为零。    对某一反应时间，就有一与最高转化率对应的温度，该温度称为最适温度。不同的反应时间，有不同的最适温度。最适温度是温度对酶促反应速率和酶失活速率双重作用的结果。如图2－12所示。

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第九章 酶促反应动力学

一、是非判断题

1．酶促反应的初速度与底物浓度无关。（ ）    

2．当底物处于饱和水平时，酶促反应的速度与酶浓度成正比。（ ）      

3．某些酶的Km由于代谢产物存在而发生改变，而这些代谢产物在结构上与底物无关。（ ）

4．在非竞争性抑制剂存在下，加入足量的底物，酶促的反应能够达到正常Vmax。（ ）

5．碘乙酸因可与活性中心-SH以共价键结合而抑制巯基酶，而使糖酵解途径受阻。（ ）

6．从鼠脑分离的己糖激酶可以作用于葡萄糖（K_m=6×10^-6mol/L）或果糖（K_m=2×10^-3mol/L），则己糖激酶对果糖的亲和力更高。（ ）

7．K_m是酶的特征常数，只与酶的性质有关，与酶浓度无关。（ ）

8．K_m是酶的特征常数，在任何条件下，K_m是常数。（ ）

9．K_m是酶的特征常数，只与酶的性质有关，与酶的底物无关。（ ）

10．一种酶有几种底物就有几种K_m值。（ ）

11．当[S]>>K_m时， V趋向于V_max，此时只有通过增加[E]来增加V。（ ）

12．酶的最适pH值是一个常数，每一种酶只有一个确定的最适pH值。（ ）

13．酶的最适温度与酶的作用时间有关，作用时间长，则最适温度高，作用时间短，则最适温度低。（ ）

14．金属离子作为酶的激活剂，有的可以相互取代，有的可以相互拮抗。（ ）

15．增加不可逆抑制剂的浓度，可以实现酶活性的完全抑制。（ ）

16．竞争性可逆抑制剂一定与酶的底物结合在酶的同一部位。（ ）

答案

1．错。   2．对。  3．对。   4．错。   5．对。  6．错。   7．对。    8．错。

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