篇一 :实验七、双向琼脂扩散试验

实验七双向琼脂扩散试验

实验七、琼脂扩散试验

一、实验目的

掌握双向琼脂扩散试验的原理、操作方法及结果判定方法。

二、实验原理

可溶性抗原(如蛋白质、多糖、脂多糖、病毒的可溶性抗原、结合蛋白等)与相应抗体在半固体琼脂凝胶内扩散,二者相遇,在比例合适处形成白色沉淀。抗原和抗体加到琼脂板上相对应的孔中,两者各自向四周扩散,如两者相对应,浓度比例合适,则经一定时间后,在抗原、抗体孔之间出现清晰致密的白色沉淀线。每一抗原与其相对应抗体只能形成一条沉淀线,若同时含有若干对抗原抗体系统,因其扩散速度的不同,可在琼脂中出现多条沉淀线。且根据沉淀线融合情况,还可鉴定两种抗原是完全相同还是部分相同。所以,可用此法来分析和鉴定标本中多种抗原或抗体成份,并用以测定抗原或抗体的效价。

三、材料与试剂

传染性法氏囊病毒标准抗原、传染性法氏囊病毒标准阳性抗体,待测鸡血清,精制琼脂粉,生理盐水、载玻片,打孔器(直径3mm)、湿盒、吸管等。

四、操作步骤

1、将琼脂糖1.0克、NaCl 8.0克、蒸馏水100ml装入三角烧瓶,煮沸,然后用吸管吸取7ml加入平皿内(勿有气泡)使成约3mm厚的凝胶,待冷却凝固后按如下图方式打孔。(注意打孔完毕要封底)

2、加样。中间孔加标准抗原,外周孔加被检血清及阳性血清(如要测被检血清的效价,外周孔可倍比稀释后依次加入)。

3、将加好样品的琼脂板置于湿盒内,于37℃温箱内放置24小时后观察结果。

结果判断:阳性:标准对照孔之间有明显的沉淀线时,受检孔与中央孔之间形成沉淀线并与阳性对照沉淀线融合。阴性:受检孔与中央孔之间无沉淀线。

五、注意事项

1、每个孔的加样量应保持一致,既使每个孔都被加满,又必须不使样品溢出孔外。

2、打孔时注意避免产生裂缝或将琼脂与玻片脱离。

六、实验报告

1、说明环状沉淀试验检测结果;

2、画出双向琼脂扩散试验中你所观察到的沉淀线,并对其进行简要说明。

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篇二 :双向琼脂扩散实验

双向琼脂扩散试验

一、实验目的

1、掌握双向琼扩试验的原理和用途

2、掌握双向琼扩试验操作方法

3、观察抗原、抗体在琼脂板中形成的沉淀线

二、原理

血清学反应:

? 凝集反应

? 沉淀反应

? 补体参与的反应

? 中和反应

凝集反应: 颗粒性抗原,或吸附在颗粒性载体表面的可溶性性抗原,与相应抗体结合, 在有适当电解质存在,经过一定时间,成肉眼可见的凝集团块 参与凝集反应的抗原称凝集原,抗体称为凝集素

沉淀反应:将可溶性抗原与相应抗体混合,在电解质存在条件下,即可形成肉眼可见的沉淀物 沉淀物只在抗原抗体比例合适时才出现

补体参与的反应: 补体结合试验是根据补体能与任何抗原抗体复合物结合,但不能单独同抗原或 抗体结合的特性,用特定的补体来检测抗原抗体间有无特异性结合

中和反应:针对病毒的一些蛋白质抗原或抗原表位的抗

体与病毒结合后可以中和病毒的感染性( 病毒中和试验可以在细胞培养、鸡胚或 动物上进行,一般将抗体作稀释,与一定量的病毒混合,然后检测其在细胞培养、鸡胚或动物上的残余感染性)? 终点是以抑制细胞病变(细胞培养)或 病毒复制(鸡胚或动物)的抗体最高稀释度来表示。 ( 中和试验具有很强的特异性,是检测病中和试验具有很强的特异性, 毒和新分离病毒毒株的鉴定最经典的方法,也可用于检测病毒感染动物血清中的抗体) 双向琼脂扩散试验,是将抗原和相应抗体分别加入同一凝胶板内的相邻小孔中。 两者相互扩散,当扩散到他们的浓度比例合适的部位相遇时,就会形成抗原抗体复合物的沉淀【可溶性抗原(如蛋白质、多糖、脂多糖、病毒的可溶性抗原、结合蛋白等)与相应抗体在半固体琼脂凝胶内扩散,二者相遇,在比例合适处形成白色沉淀。抗原和抗体加到琼脂板上相对应的孔中,两者各自向四周扩散,如两者相对应,浓度比例合适,则经一定时间后,在抗原、抗体孔之间出现清晰致密的白色沉淀线。每一抗原与其相对应抗体只能形成一条沉淀线,若同时含有若干对抗原抗体系统,因其扩散速度的不同,可在琼脂中出现多条沉淀线。且根据沉淀线融合情况,还可鉴定两种抗原是完全相同还是部分相同。所以,可用此法来分析和鉴定标本中多种抗原或抗体成份,并用以测定抗原或抗体的效价。】

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篇三 :沉淀实验——双向琼脂扩散试验

沉淀实验——双向琼脂扩散实验

内容提要:利用双向琼脂扩散试验测定不同浓度的鸡传染性法氏囊病病毒抗原药物扩散速率,观察实验结果并且总结

关键词:双向琼脂扩散试验  琼脂凝胶配制  制板  打孔  封底  加样  稀释抗原  响因素

引言:

目的:掌握双向琼脂扩散试验的基本操作和临床应用。

实验原理:琼脂的疏散网状结构有利于大分子的自由迁移,合适比例的抗原抗体结合后聚集形成沉淀,沉淀的产生组织抗原抗体复合物的自由运动,沉淀带行程一种特异性的半渗透性屏障,阻滞相同抗原抗体复合物,而允许不同的分子通过。

实验仪器和药品:Nacl、蒸馏水、琼脂粉、电炉、平皿、硫柳汞、打孔器、电子秤、酒精灯、微量移液器、微量反应板、鸡传染性法氏囊病病毒琼脂扩散试验阳性血清(兽药生字(2007)150138086青岛易邦生物工程有限公司)、鸡传染性法氏囊病病毒琼脂扩散试验抗原(兽药生字(2007)150138086青岛易邦生物工程有限公司)。

实验内容及步骤:

1.       琼脂凝胶的配制:取8g Nacl溶解于100ml蒸馏水中,加优质琼脂粉1g,电炉缓慢加热使之彻底融化。

2.       制板:将清洁的平皿置于水平桌面上,每个平皿分别倒入加热融化的1%琼脂约10ml,使其厚度大约为3mm,注意切勿产生气泡。置于4℃保存(需保存较长时间时加入1%硫柳汞1ml)

3.       打孔:冷凝后打孔,打孔器内径约3mm。按图1在固定的位置用打孔器垂直打孔,用7号针头挑去孔中琼脂。

4.封底:将琼脂平板置于酒精灯上微微加热,使孔底琼脂微融而封住孔底。

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篇四 :琼脂扩散实验原理

琼脂扩散实验原理

一、琼脂扩散实验的基本过程

1、实验目的 

掌握双向琼脂扩散试验的原理、操作方法及结果判定方法。

2、材料与试剂 

传染性法氏囊病毒标准抗原、传染性法氏囊病毒标准阳性抗体,待测鸡血清,精制琼脂粉,生理盐水、载玻片,打孔器(直径3mm)、湿盒、吸管等。

3、实验步骤 

   (1).预复琼脂玻板的制备

  将溶化的1%预复琼脂用滴管加玻板上,使之能将表面覆盖即可,放于温箱内干燥(或自然干燥),即可用以制备凝胶板。

   (2).凝胶板的制备

  溶化琼脂糖,在水平桌上将溶化的琼脂糖倒在预复琼脂玻板上,制成厚度约3~4mm厚的琼脂糖凝胶板,待冷却后根据所需形状打孔(注意不宜在室温下放置过久,尽量缩短操作时间,以免干燥)。

  梅花型:

  

   (3).免疫扩散及结果观察

  将抗原加入中心孔,倍比稀释的免疫血清加入周围孔,留1孔加双蒸水,以作空白对照(注意:加样至孔满为止,不可外溢)。待孔内液体渗入凝胶后即可放于温盒中(如需要可重复加样,加样间隔时间应掌握在第一次加样后孔内液体尚未完全扩散完的情况下即加入,以免孔周围形成不透明的白色圈)。湿盒于25℃中,一般保温24~48h,观察抗原抗体产生的白色沉淀线。

  免疫血清的滴度以一定抗原浓度下出现白色沉淀线的最高稀释度来表示。

如不知抗原浓度是否与免疫血清相当时,抗原也可倍比稀释,多做几个梅花孔以作比较。

4、标本的保存

  为了保存标本,可染色处理,步骤如下:

  (1)用生理盐水浸洗待保存的玻板2~3天,每天换水1~2次,洗去多余的抗原抗体及其他蛋白。

  (2)浸洗后于玻板的凝胶上加5%甘油或用0.5%琼脂填孔防裂,用湿的优质滤纸覆在凝胶上(两者之间不要有空气),37℃过液使其彻底干燥。

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篇五 :琼脂扩散试验

琼脂扩散试验

利用可溶性抗原与抗体在半固体琼脂内进行扩散,若抗原与抗体对应,并且比例适当,就会出现白色沉淀线,此为阳性反应。琼脂扩散试验可在试管内、平皿中以及玻片上的琼脂中进行。又可分为单向琼脂扩散试验和双向琼脂扩散试验两类。

单向琼脂扩散试验 是一种常用的定量检测抗原的方法。将适量抗体与琼脂混匀,浇注成板,凝固后,在板上打孔,孔中加入抗原,抗原就会向孔的四周扩散,边扩散边与琼脂中的抗体结合。一定时间后,在两者比例适当处形成白色沉淀环。沉淀环的直径与抗原的浓度成正比。如事先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线,则从曲线中可求出标本中抗原的含量。本试验主要用于检测标本中各种免疫球蛋白和血清中各种补体成分的含量,敏感性很高。

双向琼脂扩散试验 是将半固体琼脂倾注于平皿内或玻片上,待其凝固后,在琼脂板上打孔,将抗原、抗体分别注入小孔内,使两者相互扩散。如果抗原、抗体相互对应,浓度、比例适当,则一定时间后,在抗原、抗体孔之间出现清晰可见的沉淀线。双向琼脂扩散法可用来分析溶液中的多种抗原。一对抗原、抗体系统只能形成一条沉淀线,不同的抗原抗体系统在琼脂中扩散的速度不同,可在琼脂中形成不同的沉淀线。本法主要是用于检测血清中各种免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙肝表面抗原等。缺点是需要时间过长,灵敏度不高。

琼脂免疫扩散试验

材料与试剂

1.琼脂粉

2.平皿

3.打孔器

4.生理盐水或其他缓冲液,可加1/万的硫柳汞或叠氮钠防腐。

操作方法

1.称取一定量的琼脂粉,按1%左右(0.8%~1.5%)的比例加入生理盐水或缓冲液,水浴煮沸融化20min。

2.将融化的琼脂倒入平皿内,使厚度2mm~3mm。自然冷却。

3.根据要求(孔径即孔的直径,孔距即两孔圆心之间的距离,包括两孔的半径)按模板打孔。也可直接用组合打孔器打孔。现在一般多打成梅花形孔图。

4.挑出孔内琼脂,注意不要挑破孔缘。

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篇六 :免疫双向扩散实验

双向扩散法—抗原分析

【原理】

双向扩散法是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散而形成一定类型沉淀线的方法。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间浓度比例,而且与其分子大小及扩散速度相关。当抗原抗体存在多种系统时,可呈现多条沉淀线以至交叉反应。

【材料】

生理盐水1%琼脂管(每管约4ml)

载玻片

打孔器及打孔模板

微量加样器及塑料吸头

抗体及抗原1、2、3、4、5、6。

湿盒

【方法】

1.将已溶化的1%琼脂盐水管放56~60℃水浴箱中平衡温度备用。

2.将载玻片置于水平桌面上,倾注已溶化琼脂3.5~4ml,使成厚度约1.5mm琼脂板。

3.凝固后,将打孔模板置于琼脂板下,然后用打孔器打孔,根据不同需要可制成三角型、方阵型或梅花型。本次实验采用三角型,即每一个三角型的三个孔为一组。(因本次实验所制备的琼脂板均以载玻片为底板故根据其大小只能采用三角型同时每一琼脂板也只能制成两组。否则,如采用方阵型或梅花型则因琼脂板边缘琼脂厚度不够而使周边各孔所加抗原或抗体量不足或溢出,如制成三角型三组,因各孔相距过近相互渗透扩散而难于正确判定结果)。

4.用微量加样器加抗体各10μl。各组所余两孔各按抗原1、2为一组,3、4为二组,5、6为三组,分别各加入10μl。注意每加一样品均需更换加样器塑料吸头,以防止交叉现象影响实验结果。

5.作好记录,放湿盒中,置37℃温箱,24小时后观察结果。

【结果】

说明:

(1)融合性沉淀弧,说明两孔中抗原相同,为同一性反应。

(2)两沉淀线独自形成并形成交叉,说明两孔中的抗原完全不同,为非同一性反应。

(3)融合性沉淀弧出现支线,或同时有另一条或两条沉淀线,说明两孔中抗原有相同部分又有不同部分,此为部分同一性反应。

单向免疫扩散法(Single radil immunodiffusion)—正常人群IgG正常值检测

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篇七 :实验一_双向免疫扩散试验

实验一 双向免疫扩散试验

一、实验目的

1、熟练掌握免疫扩散法的操作步骤

2、掌握抗血清效价的测定和特异性抗体的分析技术

二、实验原理

在一定条件下,抗原能与相应的抗体相互作用,发生免疫沉淀反应。免疫扩散法就是使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇,从而形成抗原抗体复合物,由于此复合物分子量增大并产生聚集,不再继续扩散而形成肉眼可见的带状或线状沉淀带。抗原抗体复合物的沉淀带是一种特异性的半渗透性屏障,它可以阻止免疫学性质与其相似的抗原抗体分子通过,而允许那些性质不相似的分子继续扩散,这样由不同抗原或不同抗体所形成的沉淀带各有各的位置,从而可以分离和鉴定混合系统。

利用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂糖凝胶,其内部为多孔网状。而且孔径很大,可以允许大分子物质(分子量自十几万到几百万以上)自由通过。因为大多数抗原和抗体的分子量都在20 万以上,所以它们在琼脂糖凝胶中几乎可以自由扩散。而且琼脂糖凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容易等优点,因此是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质。

双向免疫扩散法测定时将加热溶化的琼脂或琼脂糖浇至玻片上,等琼脂凝固后,打多个小孔,将抗原和抗体分别加入小孔内,使抗原和抗体在琼脂板上相互扩散。当二个扩散圈相遇,如抗原和抗体呈特异性的结合且比例适当时,将会形成抗原抗体复合物的沉淀,该沉淀可在琼脂中呈现一条不透明的白色沉淀线。如果抗原与抗体无关,就不会出现沉淀线,因此可以通过该试验,用特异性抗体鉴定抗原,或反之用已知抗原鉴定抗体。

三、实验仪器和试剂

1、仪器设备

载玻片、打孔器和挑针、湿盒、恒温箱、三角瓶、移液管、微量移液器

2、试剂和材料

(1)生理盐水

(2)1.2%琼脂胶:称取1.2 g 琼脂糖,加100mL 生理盐水,加热溶解

(3)抗原及相应免疫血清:抗原为人IgG,抗体为羊抗人IgG 免疫血清

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篇八 :巨噬细胞吞噬实验&沉淀实验实验报告

实验二

一  巨噬细胞吞噬功能实验

【原理】巨噬细胞是单核吞噬细胞系统的主要细胞,局域活跃的吞噬功能。吞噬细胞受抗原刺激后活化,可使吞噬功能明显增强。

在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后,再给小鼠腹腔注射鸡血红细胞,30min后处死小鼠,取出腹腔液,以冷亚甲蓝染色,显微镜下计数吞噬红细胞的百分数,及观察吞噬细胞内鸡红细胞的数目,以判断吞噬细胞的杀伤能力,由此间接地测定机体的非特异性免疫水平。

【方法】体内法:

(1)实验前3小时,小鼠腹腔注射6%无菌淀粉液1ml,诱导巨噬细胞渗出至腹腔中。

(2)实验时,每只小鼠注射鸡红细胞1ml,轻柔腹部,使其在腹腔中分布均匀,利于吞噬。

(3)30min后,将小鼠拉颈处死,固定,打开腹腔暴露肠管,用载玻片轻擦腹腔,使腹腔液均匀涂于载玻片过,再滴一滴0.03%冷亚甲蓝溶液,盖上盖玻片。

(4)高倍镜下进行观察,计数。

【结果】

【分析】

在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后,再给小鼠注射鸡红细胞后镜检腹腔液,可观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象,并且可看到部分鸡红细胞聚集到吞噬细胞附近。

二  沉淀反应  双向琼脂扩散实验

【原理】将可溶性抗原与相应抗体分别加入琼脂板上的孔内,二者均可发生扩散,并且随扩散距离的增大浓度降低,在抗原抗体比例适宜处形成可见的沉淀线。本实验是定性实验,常用于分析抗原抗体的纯度关系以及相互关系。

【方法】

(1)制板:将熔化的1%琼脂加在载玻片上约5ml

(2)打孔:待琼脂凝固后,将载玻片置于打孔样板上,用打孔器打孔

(3)加样:在中央孔内加抗体,上下两孔加抗原1,左右加抗原二,每孔加10μl

(4)结果观察:将琼脂板置于湿盒,37℃一天后观察结果。

【结果】

在中央孔与添加抗原1的孔之间出现沉淀线,有抗原抗体反应,为阳性反应,说明抗原1与抗体相对应。中央孔与添加抗原2的孔之间没有沉淀线,说明抗原2与抗体之间不相对应。

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