实验六 纸层析法观察转氨基作用
【实验名称】:纸层析法观察转氨基作用
09救援一班 第三大组
室温:28°
(一)实验目的:
1、学习氨基酸纸层析的基本原理。
2、掌握氨基酸纸层析的操作原理。
(二)实验原理:
转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应,在转氨酶的催化下,氨基酸的а-酮酸与α-酮基的互换反应称为转氨基作用。转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中,是体内氨基酸代谢的重要途径。氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化,此酶催化氨基酸的α-氨基转移到另一α-酮基酸上。各种转氨酶的活性不同,其中肝脏的丙氨酸氨基转移酶(ALT)催化如下反应:
α—酮戊二酸 + 丙氨酸 谷氨酸 + 丙酮酸
本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物,加肝匀浆保温后,用纸层析法检查谷氨酸的出现,以证明转氨基作用。纸层析属于分配层析。以滤纸为支持物,滤纸纤维与水亲合力强,水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。有机溶剂与水不相溶,把预分离物质加到滤纸的一端,使流动溶剂经此向另一端移动,这样物质随着流动相的移动进行连续、动态的不断分配。由于物质分配系数的差异,而使移动速度就不一样,在固定相中,分配趋势较大的组分,随流动相移动的速度就慢,反之,在流动相分配趋势较大的成分,移动速度快,最终不同的组分彼此分离,物质在纸上移动的速率可以用比值Rf表示:
物质在一定的溶液中的分配系数是一定的,故比值Rf也相对稳定,因此在同一层析体系中可用Rf值来鉴定被分离的物质。
(三)实验材料与仪器:
试剂:
1、0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液。
2、0.2mol/L Na2HPO4溶液81ml与0.2mol/L NaH2PO4溶液19ml混匀,用蒸馏水稀释20倍。
3、0.1mol/L丙氨酸溶液称取丙氨酸0.891克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液中,以1.0 N NaOH仔 细调至pH7.4后, 加磷酸盐缓冲液至100ml。
…… …… 余下全文