质粒DNA抽提实验报告

一．实验目的：

1.掌握碱裂解法小量快速提取质粒DNA的方法，提取的质粒DNA可直接用于酶切，PCR扩增等。

2.学习利用水平式琼脂糖凝脉电泳初步检测DNA的纯度，构型，含量和分子量大小。

二．实验原理：碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DN结果A的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

三．实验仪器及试剂：

1.5mlEP管、高速离心机、移液枪

溶液I： 50 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L EDTA、25 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）

2毫克/毫升 溶菌酶

溶液II： 200 mmol/L NaOH、1% SDS

溶液III： 3 mol/L NaAc （pH4.8）溶液、TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl、pH 7.51 mmol/L EDTA

四．实验步骤:

1、取1.5ml细胞培养物于1.5mlEP管中，12000rpm/min离心1min，去上清液（重复一次）

2、加200μl溶液Ⅰ重悬浮细胞

3、加200μl溶液Ⅱ，轻轻摇匀，放置5min

4、加150μl溶液，轻轻摇匀，冰浴5min，12000rpm/min离心5min

5、取上清，加入等体积氯仿，摇匀，12000rpm/min离心10min

6、去上清，加入等体积异丙醇，室温放置5min，12000rpm/min离心10min

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实验一、质粒DNA的提取及检测

【实验目的】

1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤

2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术

3、学会PCR操作的基本技术

第一部分 质粒DNA的提取

一、实验原理：

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

二、仪器与试剂

1、仪器 恒温摇床、台式离心机

2、试剂 溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿

三、实验步骤

1、 将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19

质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。

2、 取1.5mL培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。

3、 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。

4、 将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。

5、 加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。

6、 加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置15min。

7、 12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。

8、 向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，

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生物学大实验（二）

实验名称：质粒扩增、提取和鉴定实验

实验目的 通过对智力扩增、提取和鉴定试验的实验原理介绍和实际操作，加深对分子生物学基本技术的理解和掌握。

实验仪器设备：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、摇床、离心机、不同型号移液枪若干支、磁力搅拌器、恒温水浴锅、电炉、制冰机、琼脂糖凝胶电泳仪、超净工作台等。

实验原理：质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，通过对细菌、放线菌和真菌的培养来实现对质粒的扩增。经过处理的线状DNA在外界环境恢复正常的时候不能够复性 而质粒DNA可以复性，从而可以实现质粒DNA和染色体DNA的分离。限制性内切酶能特意地结合于一端被称为限制性酶识别系列的DNA系列之内或其附近的特异位点上，并切割DNA。当对提取的质粒DNA进行电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。

实验步骤：

一 质粒扩增

（1）普通LB固体培养基制备：

    制备LB培养基，倒入灭菌瓶中高压灭菌，待完全冷却后，保存备用。

（2）将大肠杆菌接种于LB培养基中，37℃振荡培养过夜(200转/分)

二 质粒DNA的提取(碱法)

1将菌液倒入1.5ml的微量离心管中， 12000rpm离心一分30秒，弃去上清液，以得到较多的细菌沉淀；
2、 将微量离心管开口倒置在卫生纸上，使离心管底部的液体流尽。
3、 加入100μl用冰预冷的溶液I，剧烈振荡，将沉淀彻底悬浮，然后室温放置5分钟。
4、 加入200μl现配的溶液II，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管（不要振荡，以避免DNA断裂），使混合物混匀，冰浴5～10分钟。
5、 加入150μl预冷的溶液III，盖紧管口，温和颠倒混匀，使粘稠地细菌裂解物均匀地分布于溶液III中，冰浴5分钟。
6、 取上部水相，移入新的离心管，加入2倍体积预冷的无水乙醇（也可同时加入1/10倍体积的醋酸钠），震荡混匀，室温放置10分钟沉淀双链DNA，然后4℃，12000rpm离心10min。
7、 弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使离心管底部的液体流尽后，加 入预冷的1ml 70％乙醇。
8、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使液体流尽，置DNA干燥5～10分钟。

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质粒DNA的提取

一、实验方法

碱裂解法抽提质粒DNA

二、实验原理

基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。

三、实验步骤

1）质粒提取

1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。

2. 加入100ml溶液1，振荡至彻底悬浮。

3. 加入200ml溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟

4. 加入150ml溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。

5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。

6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA

7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀， 10，000g离心5分钟

8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇

9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA

2）质粒鉴定®琼脂糖凝胶电泳

灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I)

加样：质粒+上样缓冲液®混匀

电泳

结果观察：UV灯下

四、实验结果

五、实验分析

裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质

1、防止DNA裂解：Solution 1 

 1）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解

2）、所含EDTA抑制酶活性

2、溶解与变性：Solution2

1)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性

2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白

3、沉降与复性：Solution3

1)质粒DNA复性

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重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定

实验目的：

学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。

学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。

学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。

掌握利用Cacl2 感受态细胞的方法。

学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。      

掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。

学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。

实验原理：

外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。

重组子的构建

酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有去最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成，在双酶切体系中，限制性内切酶在使用时应遵循“先低盐后高盐，先低温后高温”的原则进行反应。

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实验一 质粒的提取酶切

实验目的

掌握质粒小量快速提取法。用琼脂糖凝胶电泳法鉴定其纯度。 实验原理

质粒是一种染色体外的稳定遗传因子。大小在1~200kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子。主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。他可独立游离在细胞质内，也可整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能却赋予宿主细胞的某些表型。

采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）可使细胞壁裂解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。用酒精沉淀洗涤，可得到质粒DNA。

在细胞内，共价闭环DNA（cccDNA）常以超螺旋形式存在。若两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环DNA（ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度都快，因此在本实验中，质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。

限制性内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序DNA片段。EcoR I和Bgl II的识别序列和切口是： EcoR I：G↓AATTC

Bgl II: A↓GATCT

G，A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的分子量。

实验步骤

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一、实验名称：质粒DNA的提取与纯化，DNA琼脂糖凝胶电泳

二、实验原理：

1.质粒DNA的提取：

质粒是一类存在于几乎所有细菌等微生物中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的DNA分子，能够自主复制和稳定遗传，以超螺旋形式存在，是最常用的基因克隆载体。除质粒外，大肠杆菌中还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂质等物质，因此需要裂解细胞并除去蛋白质和染色体DNA等物质才能分离纯化出质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验使用碱裂解法，即利用SolutionⅠ 、Ⅱ、Ⅲ三种溶液分离提取质粒DNA.其原理如下。

（1）碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理：

碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA之间变性与复性的差异来分离质粒DNA，达到分离提纯质粒DNA的目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，线性的DNA因氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的大部分氢键会被断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链相互缠绕，不会完全分离。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性，恢复其天然构象，以可溶状态存在于液相中；而线性的染色体DNA由于两条互补链彼此已完全分开、分子量大、结构复杂而相互缠绕形成不溶性网状结构。与不稳定的大分子RNA、变形的蛋白质以及细菌碎片等一起沉淀而被除去。进一步用酚、氯仿使蛋白质变性去除蛋白质杂质，然后用无水乙醇沉淀，即可获得纯化的质粒DNA。SolutionⅠ 、Ⅱ、Ⅲ三种溶液以及无水乙醇沉淀DNA的具体作用和原理如下。

（2）四种溶液作用及原理：

①Solution I的作用：悬浮大肠杆菌菌体，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉，从而起到抑制DNA酶对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。另外也可保证溶菌酶活性。

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