实验报告

课程名称：生化实验B 实验日期：

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血红蛋白凝胶过滤

一、 背景及目的

血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。存在于脊椎动物、某些无脊椎动物血液和豆科植物根瘤中。人体内的血红蛋白由两个α亚基和两个β亚基组成。每个亚基均成球状，内部有一个血红素。血红素上的亚铁离子可以可逆的与氧分子结合，起到运输氧气的作用。当携带氧气时，血红蛋白呈鲜红色，无氧时为暗红色。

凝胶过滤法又称凝胶排阻层析或分子筛层析，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。 凝胶过滤的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。

影响分离效果的因素主要有以下几点：1.基质的颗粒大小、均匀度

2.筛孔直径和床体积的大小3.洗脱液的流速4.样品的种类等，5.缓冲液的pH

6.而最直接的影响是 Kav 值的差异性， Kav 值差异性大，分离效果好； Kav 值差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开。

影响凝胶过滤的因素主要有：

1、 层析柱的选择 ：长的层析柱分辨率要比短的高，但层析柱长度不能过长。

2、 加样量：加样过多，会造成洗脱峰的重叠；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低。

3、凝胶柱的鉴定：凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。

4、 洗脱速度：洗脱速度应保持适中。

目前凝胶过滤技术的应用主要是以下几点：

1、脱盐 2、用于分离提纯 3、测定高分子物质的分子量 4、高分子溶液的浓缩 5、蛋白质的复性

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柱层析分离色素

一、【实验目的】

1．了解柱层析的分类，掌握各种柱层析的原理。

2．熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。

二、【实验原理】

叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇或无水乙醇提取。

分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。柱层析法是色谱法中的一种，它是根据混合物中各组分对固定相的吸附能力，以及对洗脱剂（即移动相）的溶解度不同将各组分分离。常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。

吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面积很大，经过活化的多孔性物质或粉状固体作为吸附剂（如氧化铝或硅胶），当混合物的溶液流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱。由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速度下移，形成色带。继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出，整个层析过程进行反复的吸附-解析-再吸附-再解吸。用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定。

本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中（压成柱状）作为吸附剂，将叶绿体色素的石油醚提取液倾于吸附柱上，色素即被吸附。由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行洗脱，从而达到叶绿体主要的4种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）的分离。

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实验一   蛋白质分子量的测定——凝胶层析法

一、实验目的

1.掌握凝胶层析的基本原理。

2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。

二、实验原理

 凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。

 凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。

将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。实质上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。Vg为凝胶本身的体积。洗脱体积（Ve）与Vo与Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi

式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可以改写为:Kd=(Ve-Vo)/Vi

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实验三    Sephadex G-25凝胶层析法脱盐和离子交换柱层析分离菠萝蛋白酶

一、Sephadex G-25凝胶层析法脱盐

（一）目的和要求

掌握凝胶层析法的原理及操作技术。

（二）原理

凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。

凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatography）、分子筛过滤（molecular  sieve filtration）、凝胶渗透层析（gel osmotic chromatography）等。它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。

凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。这样被分离物质即被按分子的大小分开。

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通过实验让学生理解影响凝胶过滤层析的因素

作者：林 珊

来源：《职业·下旬》20xx年第08期

在生物化学实验中,凝胶过滤层析,也称分子筛层析、排阻层析,是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术。笔者现将凝胶层析的用途及通过实验让学生理解掌握影响凝胶过滤层析的两种因素阐述如下。

一、凝胶层析的应用广泛

凝胶层析的应用非常广泛,最主要的应用有以下四种。

1.脱盐

高分子(如蛋白质、核酸、多糖等)溶液中的低分子量杂质,可以用凝胶层析除去,这一操作称之为脱盐。

2.用于分离提纯

凝胶层析已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强吸附力,可用于除去无离子水中的致热原制备注射用水。

3.测定高分物质的分子量

用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内,在同一条件下层析、记录每一分钟成分的洗胶体积;根据物质的洗胶体积,在标准曲线上查出其分子量。

4.高分子溶液的浓缩

二、通过葡聚糖凝胶柱层析实验,让学生理解影响凝胶过滤层析的两种因素

学生通过实验,掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。对于凝胶过滤层析的理论学习,学生普遍感到抽象、难理解。通过实验,可以让学生在实验的过程中,变抽象为直观,变难懂为易懂。在实验开展的进程中,学生可以亲眼观察到凝胶的选择和层柱大小、长短的不同均会对实验结果产生影响。

1.凝胶的选择,根据实验目的不同,选择不同型号的凝胶

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目前,市售凝胶主要包括:价格便宜的凝胶葡聚糖G-10,分离范围

在实验中,学生可以清楚地认识到:第一,选择凝胶首先要根据样品的情况确定一个适中的分离范围,根据分离范围来选择合适型号的凝胶。如果分离范围选择过小,则某些组分不能得到分离;如果分离范围选择过大,则分离率较低,分离效果也不好。第二,选择凝胶颗粒的太小。颗粒小,分辨率高,但相对的流速慢,实验时间长,有时会造成扩散现象严重;颗粒大,流速快,分辨率较低但条件得当也可以得到满意的结果。选择时,要依据分离的具体情况而定。例如,样品中各个组分差别较大,则可以选用大颗粒的凝胶,较快达到分离的目的;如果有个别组分差别较小,则要考虑使用小颗料凝胶以提高分辨率。

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凝胶层析技术的研究及应用

本文综述了凝胶层析的原理及其相关的参数和类型，以及在实际操作过程中的注意事项。并讲述了凝胶层析的一般应用。

凝 胶 层 析 （ gel chromatography ） 又 称 为 凝 胶 排 阻 层 析、分子筛层析、凝胶过滤的等。它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。

1959 年，Porath 和 Flodin 首次用一种多孔聚合物－交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离 水溶液中不同分子量的样品，称为凝胶过滤。1964 年，Moore 制备了具有不同 孔径的交联聚苯乙烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，称为凝胶渗透层析（流动相为有机溶剂） 。随后这一技术得到不断的 完善和发展，目前广泛的应用于生物化学、高分子化学等很多领域。

1、 凝胶层析原理 、

凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。 凝胶层析的固定相 是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当 含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后， 各个组分就向固定相的孔穴 内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。

比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，经历的流程短，流动速度快，先流出；而较小的分子可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，最后流出；分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透， 渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小 的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序 依次流出，从而达到了分离的目的。

2、凝胶层析相关系数 、

2.1 外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积、洗脱体积

外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流 动相的体积。

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凝胶过滤层析

凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖（如葡聚糖或琼脂糖）类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。也叫做分子排阻层析（molecular-exclusion chromatography）。一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。 一般是大分子先流出来，小分子后流出来。

基本原理

凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。

优点

它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。 使用方法

⒈凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用SephadexG-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。

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