实验六  SDS-PAGE测定蛋白质分子量

生物111  杨明轩  1102040128

一、研究背景及目的

对于那些生物体内含量高、易于分离结晶获得纯品的蛋白，可以通过测定氨基酸序列，借助各种氨基酸的分子量求出蛋白的分子量，并与质谱等手段相互结合，得到精确可信的分子量。但对于那些含量少，不易分离的蛋白，无法实现结晶，就必须借助其他手段测定其分子量。

要找到能够测定分子量的实验手段，首先要考虑那些能够将不同分子按照其各自的分子量分离的技术。在众多的技术当中，密度梯度离心、层析、电泳都与物质的分子量有关。其中，超速离心机造价高，使用过滤层析色谱测分子量要做标准曲线，柱长要求高，且这些方法不够准确。因此，电泳技术成为了实现分子量测定这一目的的最佳选择。

但是，在活性电泳中，影响蛋白前迁移率的因素有蛋白质的电荷性质、分子大小和形状。要测定分子量，就要消除电荷、分子形状对蛋白迁移率的影响，即使得各种蛋白的电荷、形状不存在显著差异。对于电荷，使各分子不带电违背电泳的基本原理，而使各分子带点完全相同是无法实现的，因此考虑使其带上大量电荷，从而让分子之间的电荷差异可以忽略。在活性电泳中，改变样品的带电情况依靠的是缓冲液pH的变化，显然不能够使分子大量带电，这就表明必须向电泳体系中引入其他物质，与蛋白分子定量等量结合，且不改变分子量差异造成泳动差异。对于分子形状，考虑到功能性蛋白大多是球形粒子，要保持形状不变，就要实现对蛋白的包裹性结合。而蛋白表面的电荷分布情况千差万别，依靠电荷性质无法结合形成稳定的复合物。考虑到蛋白质中含有大量的疏水氨基酸，可以通过疏水作用结合，这就要造成蛋白变性，是疏水基团充分暴露出来，分子不能在维持球型而变成棒状，因此，所选择的物质还需要能够维持复合物形状的统一。基于以上考虑，科学家选择了双亲性物质，既能通过疏水作用与蛋白定量结合成牢固的复合物，又能借助亲水性在溶液中良好分散。

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实验六  SDS-PAGE测定蛋白质分子量  预习报告

生物111 杨明轩 1102040128

一、研究背景

在生物学研究中，有时我们需要得到纯化后的蛋白质的分子量数据，一是可检验分离纯化的效果，二是为后续研究做准备。例如作为蛋白质制剂，其分子量大小与安全性有密切关系，一般分子量越大产生过敏性的可能越大，因而在蛋白制剂中控制检测分子量大小是一个重要课题。

蛋白质分子量测定方法有超速离心法、凝胶过滤色谱法等，但这些方法不够准确，实验室中用于测定蛋白质分子量的方法较多用的是SDS—凝胶电泳法。这种方法最适宜测定分子量是15, 000- 100, 000的样品, 对低于10, 000分子量的水解蛋白不太适用。通过改进，用强电解质离子为前导离子和拖尾离子可对分子量低于10, 000的水解蛋白样品进行分子量测定。用这种方法测定蛋白质的分子量,分辨率高，所需设备廉价，与用其他方法测得的分子量相比，误差一般在±10 %以内，因而其广泛应用于蛋白分离纯化和分子量测定。

实验四中，我们通过凝胶过滤层析获得了初步提纯的麦清蛋白。在进一步的研究当中，必然要测定其分子质量。从实验五中，我们利用活性聚丙烯酰胺垂直板电泳实现了过氧化物酶同工酶的分离与定性分析，了解了电泳技术是目前用于大分子分析鉴定的常用手段，因此，考虑采用电泳的手段实现测定麦清蛋白分子质量的目的。

而要达到测定麦清蛋白分子质量的目的，首先则要使其不同的蛋白只按照分子量的差异分离开来。通过实验五我们可以发现，在活性电泳中，不同蛋白质因各自电荷性质、分子大小和形状的不同，在一定pH条件下，在电场中表现出不同的迁移率；可以实现不同蛋白的分离，但无法达到只按照分子量不同而分离。而在1927年Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与原来所带的电荷和分子形状无关。由此产生了蛋白质变性电泳，目前常用的是SDS-PAGE。本次实验就将采用SDS-PAGE，实现对麦清蛋白分子质量的测定。

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实验二 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法

（SDS-PAGE）测定蛋白质的分子量

1 原理

1.1聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理

1.1.1性能

聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。

1.1.2 制备原理

聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。本实验是用化学聚合。化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。

1.1.3 凝胶浓度和交联度与孔径的关系

凝胶浓度根据被分离的物质的分子量大小确定。当分析一个未知样品时，常先用7.5%的标准凝胶或用4~10%的凝胶梯度来试测，而后选出适宜的凝胶浓度。凝胶的机械性能、弹性是否适中很重要，胶太软易断裂，；太硬则脆，也易折断。

1.2 SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量的原理

蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于所带净电荷及分子的大小和形状等因素。如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS和巯基乙醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。

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1 引言

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前分离蛋白质亚基并测定其分子量的常用方法，为检测电泳后凝胶中的蛋白质，一般使用考马斯亮蓝（CBB）染色^[1]。本次实验的目的在于学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质的操作技术。

2 材料和方法

2.1  实验原理

2.1.1 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理

2.1.1.1 性能

聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。

2.1.1.2 制备原理

聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。本实验是用化学聚合。化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。

聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统，不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4％，pH = 6.8，分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5％，pH = 8.8。电极缓冲液的pH = 8.3，用Tris、SDS和甘氨酸配制。配胶的缓冲液用Tris、SDS和HCl配制。

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电池MSDS与SDS有什么不同？

很多人认为SDS和MSDS是一个概念，MSDS也叫SDS，其实不然，下面我们从以下几个方面来对MSDS和SDS作一个入门认知。

定义

SDS：SDS是Safety Data Sheet的首字母缩写，即：安全数据表/安全说明书。REACH法规（指令号：EC 1907/2006）在附录Ⅱ中规定了SDS的内容，该附录于20xx年5月通过指令453/2010进行了修改。

MSDS：MSDS是Material Safety Data Sheet的首字母缩写，即：物质安全数据表/物质安全说明书。关于MSDS的制定标准有很多，主要有GHS，ANSI, ISO，OSHA，WHMIS制定的标准。

内容

SDS：主要内容包括化学品及企业信息、危害鉴定、成分信息、急救措施、消防措施、泄露措施、搬运和储存、暴露控制、理化特性、毒理学信息、生态毒理学信息、废弃物处置措施、运输信息、法规信息及其它信息16 部分内容。

注：1. 若是经REACH注册过的物质，必须在SDS上提供注册号码。

2. 对于年销量超过10吨的危险物质，必须增加ES（暴露场景）作为SDS的附件。

3. 若物质或配制品进行了CSA（化学品安全评估），则SDS及EC的内容必须与CSA中的信息保持一致。

MSDS：目前大部分使用的是16项格式的MSDS，内容标题同SDS相同

OSHA制定的MSDS有8项内容：制造商与产品信息、成分信息、理化特性、燃烧与爆炸数据、反应活性数据、健康危害数据，安全操作与使用方法、防护措施。

WHMIS制定的MSDS有9项内容：制造商与产品信息、成分信息、理化特性、燃烧与爆炸数据、反应活性数据、毒理学特性、预防措施、急救措施、其它信息。

适用对象

SDS：

1. 参照法规67/548/EEC或1999/45/EC分类的危险物质或是PBT/vPvB或SVHC中的物质；

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SDS与MSDS一样吗？诚通专业解答SDS与MSDS异同点 很多人认为SDS和MSDS是一个概念，MSDS也叫SDS，其实不然，下面我们从以下几个方面来对MSDS和SDS作一个入门认知。

定义：

SDS：SDS是Safety Data Sheet的首字母缩写，即：安全数据表/安全说明书。REACH法规（指令号：EC 1907/2006）在附录Ⅱ中规定了SDS的内容，该附录于20xx年5月通过指令453/2010进行了修改。

MSDS：MSDS是Material Safety Data Sheet的首字母缩写，即：物质安全数据表/物质安全说明书。关于MSDS的制定标准有很多，主要有GHS，ANSI, ISO，OSHA，WHMIS制定的标准。

内容：

SDS：主要内容包括化学品及企业信息、危害鉴定、成分信息、急救措施、消防措施、泄露措施、搬运和储存、暴露控制、理化特性、毒理学信息、生态毒理学信息、废弃物处置措施、运输信息、法规信息及其它信息16 部分内容。 注：1. 若是经REACH注册过的物质，必须在SDS上提供注册号码。

2. 对于年销量超过10吨的危险物质，必须增加ES（暴露场景）作为SDS的附件。

3. 若物质或配制品进行了CSA（化学品安全评估），则SDS及ES的内容必须与CSA中的信息保持一致。

MSDS：目前大部分使用的是16项格式的MSDSSDS相同

OSHA制定的MSDS有8项内容：制造商与产品信息、成分信息、理化特性、燃烧与爆炸数据、反应活性数据、健康危害数据，安全操作与使用方法、防护措施。 WHMIS制定的MSDS有9项内容：制造商与产品信息、成分信息、理化特性、燃烧与爆炸数据、反应活性数据、毒理学特性、预防措施、急救措施、其它信息。

适用对象：

SDS：

1. 参照法规67/548/EEC或1999/45/EC分类的危险物质或是PBT/vPvB或SVHC中的物质；

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加拿大SDS签证材料清单

尊敬的客户，您好：

如果您的雅思成绩高于6.0分，您可以通过加拿大学习直入计划申请签证，该申请对资金证明要求有所降低。为确保您能顺利及时获得签证，我们请您配合准备以下材料：

1. 申请人护照原件（有效期至少要至20xx年6月）

2. 申请人身份证复印件或者扫描件（正反面在同一页）

3. 领馆签证受理费用1141.50人民币 （领馆签证费：￥880；签证中心：￥211.50；签证中心快递回寄：50元，其中只有签证中心费用有#5@p）

4. 加拿大大学录取信复印件（不要原件）

5. 由指定体检医师提供的体检表格副本（领馆指定体检机构联系方式请看附件，体检费用请体检当天自行缴纳，具体建议体检时间请咨询签证老师）

6. 签证照片8张 （照片要求详见附件，35mm X 45mm，4张给启学教育老师用于签证，4张用于体检）

7. 雅思成绩报告单原件（总分不得低于6.0，需要在2年内参加的考试）

8. 加拿大签证信息登记表 （即我们提供的非正式版，中文填写即可，请详细填写各项信息，如生日必须具体至日，地址具体至门牌号几零几室）

9. 高中毕业证书公证件 (注：是公证件)

10. 高中盖章成绩单公证件 (注：是公证件)

11. 大学毕业证书公证件或者在读证明公证件 (注：是公证件)

12. 大学成绩单公证件

13. 若申请人年满18岁及以上，请提交无犯罪记录公证件。(注：是公证件，先去户口所在地派出所开具无犯罪记录证明，然后再凭证明去公证处办理无犯罪记录公证件)

14. 如果学生去魁北克的学校，需要先办理魁北克的入境许可，该许可办理需要1个月左右。

15. 签署好的SPP（学生合作计划）信息披露表（该表来自于加拿大皇家银行）

16. 由加拿大皇家银行出具的金额为10100万加元、可负担申请人在加第一年生活费用的担保投资证(GIC)

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