实验十二 微生物实验操作基础——灭菌及无菌操作

一、目的要求 学习灭菌的方式方法，区别几种灭菌方式的相同点和不同点。掌握实验室无菌操作的操作方法和注意事项，体会无菌操作技术在微生物研究中的重要性。

二、知识介绍

灭菌技术sterilization

为什么要灭菌？（杂菌污染的后果）

1.营养基质或产物被消耗损失；

2.抑制生产菌的生长；

3.抑制产物的生物合成；

4.杂菌繁殖导致培养液性质（如pH）改变，造成生物反应异常。

灭菌原理与方法

灭菌(sterilization）是指利用物理或化学方法，杀灭或去除物料或设备中所有微生物的技术或 工艺过程。灭菌方法有化学物质灭菌、辐射灭菌、过滤介质除菌和热灭菌等。

（一）、化学物质灭菌

通过改变微生物细胞膜的渗透性，或者损伤细胞膜，影响微生物细胞的正常代谢。

不适合于培养基的灭菌，只适合于局部空间或某些器械的消毒。

1.无机酸、碱及盐类

酸碱的杀菌能力主要由其电离度而定，电离出得氢离子或氢氧根离子浓度越高，杀菌力越强。

盐溶液的杀菌力与其浓度成正比。

（腌咸菜可以保藏很长时间而不染菌）

2.重金属盐

杀菌原理是重金属盐使细胞中蛋白质失活。

比如升汞。

服食牛奶、

鸡蛋等高蛋白含量食物可解毒。

3.氧化剂

高锰酸钾

4.有机化合物

乙醇：脱水、使蛋白质变性和沉淀，70~75%最有效。

(二)、辐射灭菌

1.紫外线：诱导胸腺嘧啶二聚体的形成，从而抑制了DNA的复制；空气在紫外线照射下产生臭 氧，臭氧也具有一定的杀菌作用。

2.X射线、γ射线：能量极高，被菌体吸收后，菌体内的水和有机物产生强烈的离子化反应，形成OH-、过氧化氢和有机过氧化物，这些过氧化物阻碍微生物的代谢活动而导致菌体迅速死亡。

（三）、过滤介质除菌

工业上利用过滤的方法制备大量的无菌空气，供好氧微生物的深层培养使用。

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细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程

1．原代培养（primary culture）

直接从有机体中取出的细胞、组织或器官开始进行体外培养直到第一次传代为止。这种培养称之为原代培养。

2．传代培养（subculture）

细胞从一个培养皿以1：2或1：2以上的比率转移或移植到另一个器皿的培养，这种培养称之为传代培养。

3． 悬浮培养（suspension culture）

细胞培养的一种类型。培养时通过一特殊的装臵，使细胞瓶按一定的速度不断地转动，使细胞始终处于悬浮状态中进行增殖。

4．克隆（clone）

克隆指的是从一个细胞靠有丝分裂获得的一个细胞群体（population）。

5．细胞系（cell line）

在第二届细胞和组织培养专题讨论会上提出细胞系的概念为“原代培养物经首次传代成功后即成为细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（lineages of cells）所组成。如果不能继续传代或传代数有限，可称有限细胞系（finite cell line），如果可以连续传代，则可称为连续细胞系（continous cell line）。以前认为细胞系来自细胞发生了遗传突变，并带有癌变的特点，这种细胞有可能在培养条件下无限的传下去。这种细胞的特点是染色体为异倍体，丧失了正常细胞的“接触抑制”的特性。

6．细胞株（cell strain）

细胞株的概念如下：由原代培养中，用选择或克隆代，选出具有特征标记的细胞，经传代形成细胞株，这些特性或标记在以后的培养中必须保持下去。以前认为经体外传代培养后细胞不表现退化现象，大约可传50代以上者，其染色体维持二倍体不变，保留正常细胞的“接触抑制”等特性。

一 常用设备

一 准备室的设备：

双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放臵未消毒物品）、储品柜（放臵消毒过的物品）、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配臵溶液室搅拌溶液）。

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实验2、实验准备与无菌操作规范

【实验目的】 1.掌握细胞培养的基本概念

2.了解细胞培养的基本条件

3. 掌握清洗和消毒的基本方法

4. 学习细胞培养使用液的配制及准备方法

【实验原理】 1.体外培养（in vitro culture) 的基本概念

将活体结构成分（甚至个体）从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。按照体外培养的结构成分，可将体外培养人为地分为：组织培养（tissue culture）、器官培养（organ culture）、细胞培养（cell culture)

（1）器官培养（Organ Culture） 培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。

（2）组织培养(Tissue Culture)是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在模拟体内生理环境下，使之 生存和生长并维持其结构和功能的方法。

（3）细胞培养(Cell Culture)是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。

2. 组织细胞培养的优点

能够长时间观察细胞的生命活动

容易控制实验条件，有利于生物学研究

容易直接采集细胞及亚细胞结构的图象

便于各种细胞染色处理和标记

培养细胞的单一性，有利于排除干扰因素

3. 体外培养技术的应用：

基础研究：细胞生物学乃至整个生命科学研究中最基本的实验技术之一。被培养的组织或细胞是良好的实验材料。细胞培养广泛应用于现代医学和生物科学研究之中 生产实践：疫苗生产、药物研制与肿瘤防治等医学实践提供了全新的手段

4. 组织细胞培养的基本条件

（1）无污染的环境条件

35－37℃(人和哺乳动物细胞)

（3）气体环境与pH环境： pH7.2-7.4 (人和哺乳动物细胞)

（4）营养条件

（5） 其它条件：等渗条件、附着底物

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动物实验

实验目的要求： （1）强化训练无菌操作观念及技术。

（2）练习开腹与关腹的常规步骤与方法。

（3）训练手术基本操作：切开、止血、结扎、缝合和学会荷包缝合。

（4）熟悉胃穿孔修补的基本原则和方法。

（5）通过动物阑尾切除了解人体阑尾切除术的手术步骤。

器材：卵圆钳、手术刀、组织剪、线剪、组织镊、有齿镊、直、弯血管钳，拉钩，持针钳，缝针、丝线、

纱布、肠钳、注射器、5或7号针头。

兔阑尾切除术（仿人阑尾切除术，图12）

25％乌拉坦4ml/kg体重由兔的耳缘静脉注射进行麻醉，成功后将其仰卧平放并绑缚在实

2遍，铺无菌洞巾。

10cm，出血点用直血管钳钳夹后用1

号丝线结扎切开一小口(图12—2)。术者和第一助手各持一把弯血管钳夹持对侧切口边缘，将其提起，用组织剪纵向剪开，此时可用长镊子或左手食指和中指插入腹腔，沿切口平行方向将内脏推向深面，以免损伤内脏（图12

12cm，呈卷曲状，籍系膜与回肠相连，其颈部变细，近端开

丝线贯穿缝扎(图12—4)，以控制出血。也可以先在阑尾的基部分别分离阑尾的动脉，各夹两把血管钳，离断缝扎，再将阑尾系膜的内外侧浆膜仔细剪开，这样就可以使阑尾与回肠之间的联接变松、距离变宽，

(图12—5)。作荷包缝合时缝针只穿透浆膜层和肌层，而不穿透肠腔，同时宜将荷包缝合在结肠上。阑尾周围用湿纱布垫好，以免切除阑尾时其内容物流入腹腔和涂擦石碳酸时溅到它处。在阑尾结扎线远侧0.3—0.5cm处用直血管钳钳夹阑尾，紧贴直血管钳用手术刀切除阑尾，残端顺次用棉签蘸纯石炭酸、70％酒精和盐水（三联棒）涂擦消毒和破坏阑尾残端粘膜，以防止术后因粘膜继续分泌液体而形成囊肿（石炭酸涂于残端粘膜内面，切勿溅到它处引起组织

兔胃穿孔修补术（仿人胃穿孔修补术，图11－1）

操作步骤方法：

(1) 麻醉、消毒、铺巾、开腹、关腹同实验1。

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工艺实验室无菌操作规程

一、工艺洁净程度划分

工艺洁净划分为：一般控制工序、严格洁净控制工序。

其中一般控制工序为粉碎，提取工序、不与操作人员和外界空气直接接触的工序；严格洁净控制工序为喷雾干燥包装工序、与外界直接接触的暴露工序。

严格洁净控制工序操作过程严格控制，需要穿带消毒后的白大褂、帽子、口罩，手用酒精或杰尔灭消毒再进行操作。

二、工艺实验室更衣流程

1、进入实验室更换工作服。

2、进入净化区域前先洗手后更换白大褂、戴帽子、口罩。

3、进入干燥区域前先在缓冲间更换专用灭菌白大褂、帽子、口罩。

4、手用酒精进行消毒，戴无菌手套后进入干燥区域进行成品收集工作。

5、严格控制区域的白大褂、帽子、口罩不得带出洁净区域，如需带出，灭菌后再带入洁净区域。（非一次性使用的大褂和帽子一周清洗一次，口罩两天清洗一次，清洗干净后采用杰尔灭或84洗涤液浸泡15分钟，在洁净区域内晾干。）

三、实验室消毒灭菌

1、实验室首次使用前进行卫生清洁。

2、设备仪器外表面尤其是手部接触的阀门、按钮部位用84消毒液、

75酒精或杰尔灭浸泡抹布，拧干后擦拭进行消毒，早晚各一次。

3、净化区和干燥区进行紫外灭菌

1）使用前，紫外灭菌30分钟，关闭紫外灯后，进入并进行正常工作。

2）干燥区域使用前，紫外灭菌30分钟，关闭紫外灯进行干燥喷雾。

4）如果有人员频繁进出干燥间，或者喷雾开机距离成品收集间隔超过3h，喷雾工作结束前15min，开启紫外灯进行灭菌，操作人员隔窗监控数据，关闭紫外灯后，进行成品收集和干燥塔清洗。确保成品收集容器（比如烧杯、自封袋等）灭菌。

4、地沟每周周一用次氯酸钠或新洁尔灭进行灭菌。

四、实验室设备灭菌（这个光祥你们自己定，我也不知道是否合适，总体建议：小型设备，所有的清洗过程能采用杀菌剂清洗就用杀菌剂，比如干燥设备，清洗过后可以用杰尔灭喷淋或用杰尔灭浸泡的抹布擦拭。）

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微生物实验报告

一 环境中的微生物的检测和分离纯化

实验目的：

1 学习并掌握无菌操作技术原理和方法

2 学习用稀释涂布法分离微生物

3 认识微生物存在的普遍性，体会无菌操作的原理

实验材料：

1 土样溶液0.5ml，无菌生理盐水

2 取液器(1000μL一支，100μL一支)，培养箱，培养皿(12个)，无菌有帽试管，三角瓶，无菌涂棒，接种环，1000μL无菌吸头若干，记号笔，酒精灯，火柴，试管架

实验步骤：

A 培养基的制备(已提前制备好)

B 周围环境中的微生物的检测，在牛肉膏蛋白胨培养基平板上作如下实验

         1 取三个平板，用100μL的取液器分别吸取100μL的河水、豆浆、豆奶，均匀加在三个培养基上，并用无菌玻璃涂棒涂布均匀(要多涂几次，时间约1-2分钟，使细菌均匀分布)。

         2 再取三个平板，三个同学分别用手指(未洗过)在培养基上涂抹几秒钟，一个同学对应一个平板。

         3 再取一个平板，其中一个同学将手用肥皂洗过后，再在培养基上涂抹。

         4 再取一个平板，打开皿盖，一个同学对着培养基咳嗽，使口腔中的气流和飞沫落到培养基上。

         5 再取一个平板，打开皿盖，在空气中放置10min左右，关上皿盖。

         6 将上述9个平板放置在35℃的培养箱中培养24h。

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无菌操作技术及其重要性

  杨昆霖1    郑涛1   张雷1   张哲1   李杰2

1.北京大学医学部临床医学08级一班学生  2.北京大学医学部微生物学系副教授

【摘要】  目的：建立无菌观念，认识无菌操作的重要性，学习并掌握基本的无菌操作方法。方法：对暴露于空气中不同时间长短的琼脂培养基进行培养并观察；对不洗的手和洗过手但擦干与没擦干的手在培养基上按手印并对培养基进行培养；运用无菌接种技术接种并培养大肠埃希氏菌和表皮葡萄球菌；运用紫外光线照射培养中的细菌并观察被照射部分的菌落生长情况。结果：暴露在空气中的培养基上生长出了菌落，且菌落的数量随暴露在空气中的时间增长而增加；洗手组和不洗手组均出现了数量不等的菌落；紫外线照射下的培养基上没有菌落生长或菌落少于非照射组。

【关键词】  无菌操作；接种；培养；重要性

尽管我们的肉眼无法直接看到细菌的踪影，但在空气中，人体皮肤表层和深层，细菌却是无处不在。而在实验研究中，保证实验用具和试验用微生物不被杂菌污染显得尤为重要。生活中或是实验中，人们常常可以通过各种方法（洗液清洗、紫外杀菌等）来达到减少细菌或是灭菌的状态。本实验通过细菌培养的方法验证空气和人的皮肤存在大量细菌，运用紫外光照射培养基验证紫外线灭菌作用。

1 材料与方法

1.1材料

器材：琼脂平板培养基；洗手液；擦手巾；紫外灯；恒温培养箱；接种环；酒精灯；打火机。

菌种：大肠埃希氏菌；表皮葡萄球菌。

1.2方法

1.2.1  空气暴露组  把实验室里的八个小组按顺序依次编号为1-8组（本组为第二组），从第1组开始至第8组，分别取一块琼脂培养基，依次将培养基暴露在实验室空气中5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min；然后将培养基放入恒温箱培养两天后取出观察。

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