酶联免疫吸附测定实验报告

ELISA

一 实验原理

酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。ELISA过程包括：抗原(抗体)吸附在固相载体上——包被，加待测抗体(抗原)，加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)-待测抗体(抗原)-酶标记抗体的复合物，在于该酶的底物反应生成有色产物。然后借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。

ELISA常用的有4种方法，分别是直接法、间接法、双抗体夹心法和竞争法。在我们的实验中，采用的是间接法。主要步骤有：将抗原吸附于固相载体表面；加抗体，形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物(测定底物的降解量=抗体量)。

二 实验用品及器具

1 聚苯乙烯微量细胞培养板(平板，96孔)

2 酶联免疫检测仪

3辣根过氧化物酶羊抗兔IgG

4 包被液

0.05mol/L 碳酸缓冲液(pH 9.6)

Na2CO3 0.15g

NaHCO3 0.293g

蒸馏水稀释至100mL

5 稀释液(PBS-Tween)

NaCl 8g

KCl 0.2g

KH2PO4 0.2g

Na2HPO4 ·10H2O 2.9g

6 Tween-20,0.5mL

蒸馏水加至1000mL

7 洗涤液：同稀释液

8 封闭液：质量分数为0.5%的BSA(用PBS配制)

9 邻苯二胺溶液(底物)

配置：0.1mol/L柠檬酸(2.1g/100ml)，取6.1ml

0.2mol/L Na2HPO4·12H2O(7.163g/100ml)，取6.4ml

加蒸馏水12.5ml

取邻苯二胺8mg(溶解)

临用前加30%(体积分数)H2O240μL

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Test1. Production of antibody

[principle]

1. In the special humoral immune response, antigen can stimulate immune system to produce specific antibodies. Each antigen molecule has several different antigenic determinants, so it can be recognized by different B cells and then these B cells will produce different specific antibodies that can bind with epitopes specifically. The immunity serum produced by using antigen to immune animal is a mixture of many different antibodies, called polyclonal antibody. The most common method to produce polyclonal antibody is using pure antigen to immune animal.

2. The factors influencing producing of antibodies is related to antigen purity, animal, amount of antigen, ways of injection, times of immunity, etc.

Primary immune animal, the antigen enter animal for the first time, the body will produce a small amount antibodies after a latency, but when second injection antigen to the animal, there will be a fast response to the antigen and a lot antibodies will be produced. So in this test, use antigen to immune mice 3 times, then we can detect antibodies in the serum.

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ELISA实验数据处理方法

如果是新的数据，你只要双击图表，把它输入到图表的数据中，就可以拟和曲线。根据曲线方程式，计算出浓度。

方法：

1、拟和曲线：

输入第一行： 浓度值， 如0 10 50 100 400 输入第二行：该浓度下的调整后的

0 0.586 1.397 1.997 3.42 od值，如

选择这些输入的数据，用插入里的图表按钮，进入图表向导，在“标准类型”中选择“xy散点图”；在“子图表类型”中选择“折线散点图”，按“下一步”；选择“系列产生在行”，按“下一步”；数据标志，可以填写：如数据y轴，OD值；数据x轴，浓度；按下一步，点击完成。可得曲线图。 单击曲线，按右键，选择“添加趋势线”，在类型中，选择多项式；在选项中，选择显示公式，选择显示R平方值。

得到公式和R平方值。

也可以用上面说的方法： 双击图表，把它输入到图表的数据中，就可以拟和曲线。

2、计算浓度：

第一次实验：

标准曲线为：

y = -4E-05x2 + 0.026x

R2 = 0.9745

为例，已知OD值，计算浓度。

由于y = -4E-05x2 + 0.026x，所以可以得到：

4E-05x2 －0.026x ＋y＝0

ax2 ＋bx ＋y＝0

a＝4E-05；b＝ －0.026；

x＝（－b－（b*b－4ay）（平方根）） /(2*a)

代入a，b，和y值，得

x＝（0.026－（0.026*0.026-0.00016*y）(平方根）)/(2*0.00004） 在excel里可以用以下公式表示：

x＝(0.026-EXP(LN(0.026*0.026-0.00016*y)/2))/(2*0.00004)

通用公式为：

x＝（－b－EXP(LN（b*b－4ay）/2)）/(2*a)

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ELISA原理 －－操作规则（新手适用）

酶联免疫吸附实验 ELISA

    一．实验目的

     酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。

    二．实验原理

    用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。

     辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。

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ELISA实验数据处理方法

方法：

1、拟和曲线：

输入第一行： 浓度值， 如0 10 50 100 400

输入第二行：该浓度下的调整后的od值，如0 0.586 1.397 1.997 3.42

选择这些输入的数据，用插入里的图表按钮，进入图表向导，在“标准类型”中选择“xy散点图”；在“子图表类型”中选择“折线散点图”，按“下一步”；选择“系列产生在行”，按“下一步”；数据标志，可以填写：如数据y轴，OD值；数据x轴，浓度；按下一步，点击完成。可得曲线图。

单击曲线，按右键，选择“添加趋势线”，在类型中，选择多项式；在选项中，选择显示公式，选择显示R平方值。

得到公式和R平方值。

也可以用上面说的方法： 双击图表，把它输入到图表的数据中，就可以拟和曲线。

2、计算浓度：

第一次实验：

标准曲线为：

y = -4E-05x2 + 0.026x

R2 = 0.9745

为例，已知OD值，计算浓度。

由于y = -4E-05x2 + 0.026x，所以可以得到：

4E-05x2 －0.026x ＋y＝0

ax2 ＋bx ＋y＝0

a＝4E-05；b＝ －0.026；

x＝(－b－(b*b－4ay)(平方根)) /(2*a)

代入a，b，和y值，得

x＝(0.026－(0.026*0.026-0.00016*y)(平方根))/(2*0.00004)

在excel里可以用以下公式表示：

x＝(0.026-EXP(LN(0.026*0.026-0.00016*y)/2))/(2*0.00004) 通用公式为：

x＝(－b－EXP(LN(b*b－4ay)/2))/(2*a)

您可以应用excel的公式拷贝功能，计算所有浓度

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ELISA缓冲液配方

书中ELISA封闭液：含5%脱脂奶粉或者5%BSA的PBS，请问5%BSA指的也是质量分数吗？，因为师姐笔记写的是体积分数，网上查了查也没弄清楚，请指教。

样品稀释液可以直接就用PBS稀释吗？文献上提到稀释液中也含脱脂奶粉或BSA，请指教 PBST中吐温-20的体积分数为0.05%，这个含量是固定的吗？1.含5%脱脂奶粉或者5%BSA的PBS，5%BSA用质量分数即可；

2.样品稀释液一般可以用洗液直接稀释，也可加入一些蛋白（如脱脂奶粉或BSA）或牛、兔等血清，要根据你的试验而定；

3.至于PBST中吐温-20的体积分数，可以0.05%—0.2%，可以在你试验过程中摸索。

4.提供一般科研用简单配方，这些你都可以在网上或别人的文章中查到，仅供参考： 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M

KH2PO4 0.2克

Na2HPO4·12H2O 2.9克

NaCl 8.0克

KCl 0.2克

Tween-20 0.05％ 0.5ml

加蒸馏水至1000ml

封闭液：

牛血清白蛋白(BSA) 5克

加洗涤缓冲液至100ml。

稀释液：

牛血清白蛋白(BSA) 1克

加洗涤缓冲液至100ml

或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。BSA最好现配，价格又比脱脂奶粉贵，所以宜少量现用现配！

BSA一般是质量体积比，正如楼上所说，1%～3%为宜，如果实在是结果假阳性多，可加到5%！

TBST中吐温的浓度与你的洗涤强度（洗涤次数，洗涤时间，振荡幅度）有关，需要按实验数据来变化！

一、操作步骤

用于检测未知抗体的间接法

1. 包被：用0.05MpH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原稀释至蛋白质含量为

1~10μg/mL。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1mL，37℃温育2小时。弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）

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ELISA基本步骤和主要试剂、材料

注意：本步骤为间接ELISA步骤

一 主要步骤

1 包被

取所要包被的物质，提前设计好所需浓度，根据包被孔数计算所需包被物的量，用包被液稀释至所需体积，分加至各孔中。

包被条件：两种选择：一是将ELISA板直接臵4℃过夜；也可以先臵37℃孵育2小时再转入4℃过夜。

2 洗涤

包被结束后弃掉包被液，用PBST进行洗涤，方法为PBST加满每孔，静臵5-10min，弃掉洗液，重新加满，重复洗涤3-5次，最后拍干ELISA板等待下一步封闭。 3 封闭

常用10%小牛血清，取第2步的ELISA板加封闭液至每孔，体积至少为所加包被液的两倍。封闭条件也有两种选择：直接臵于4℃过夜，或者臵于37℃温育2-4h，具体何种条件不同物质的ELISA可能不同。

4 洗涤

封闭结束的ELISA板进行洗涤，方法同步骤2。最后拍干等待加入一抗。 5 加入一抗

一抗即为你要检测的物质，一般加之前需要稀释，具体稀释倍数不同实验 不同需要自己摸索。一抗样品一般用包被液稀释，稀释到所需浓度后加入到相应孔中。反应条件为37℃孵育2h。

6 洗涤

具体同步骤4。

7 加相应HRP-标记的商品化二抗

加相应的商品化HRP-标记的二抗（如一抗为鼠源物质则对应加抗鼠二抗），一般也用封闭液稀释，稀释倍数参考二抗说明书。将稀释好的二抗加入各孔，37℃反应1-1.5h。

8 洗涤

具体同步骤4。

9 显色

常用OPD作为显色底物，但OPD致癌，也有用TMB作为底物，，这里只介绍前者。显色需要配臵显色液，具体方法为：在步骤8进行到一半使配臵显色液，为10ml底物缓冲液加0.015g OPD粉末（实际操作由于OPD有毒不方便称量故只需稍微加入一点即可），等待OPD完全溶解。待步骤8完成后取150ul 3%过氧化氢溶液加入之前配臵的10ml溶液中混匀，立即将此显色液分加至ELISA各孔中。然后将ELISA板臵于37℃反应约10min。

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