生化实验报告
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实验1.多酚氧化酶(PPO)的分离提取
一、实验原理与目的
植物受到机械损伤和病菌侵染后,PPO催化酚与O2氧化形成为醌,使组织形
成褐变,以便损伤恢复,防止或减少感染,提高抗病能力。但是PPO的存在是水果、蔬菜褐变的主要原因之一,影响一些经济植物产品的质量。多酚氧化酶活性高低也是马铃薯解除休眠的指标之一。
本实验将采用马铃薯为主要材料,通过细胞组织破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。通过本项实验,学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法,掌握相关仪器设备的操作使用,以及蛋白质的提取、分离的系统技术。
二、实验材料与试剂
1.材料:马铃薯(大约每小组100-200g)
2.试剂:0.03M磷酸缓冲液pH6.(内含0.02M巯基乙醇,0.001M EDTA,5%甘油,1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制时配×10倍的浓缩液1000ml; 固体硫酸铵;0.03M磷酸缓冲液pH6.0(内含0.02M巯基乙醇,0.001M EDTA,0.005M MgCl2)配制时配×10倍浓缩液100ml;0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4(内含0.001M EDTA)配制时配×10倍浓缩液1000ml; NaCl; 聚乙二醇: DEAE-纤维素 DE52; 葡聚糖凝胶Sephadex G-200:
三、 实验步骤
(1)粗酶提取: 马铃薯丁按1:1(W/V)比例与0.03M磷酸缓冲液pH6.0(内含0.02M巯基乙醇,0.001M EDTA,5%甘油,1%的聚乙烯吡咯烷酮)混合,匀浆后4层纱布过滤,滤液以6000rpm离心10min,弃除沉淀获得酶提取液。
(2)盐析分级沉淀:在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40%饱和度(边加边搅拌达到充分溶解),然后6000rpm离心20min弃除沉淀;离心上清液再加入固体硫酸铵达到70%饱和度(边加边搅拌达到充分溶解),再以6000rpm离心20min,弃除上清液,收集粗酶沉淀;沉淀用0.03M磷酸缓冲液pH6.0(内含0.02M巯基乙醇,0.001M EDTA,0.005M MgCl2)溶解,装入透析袋中用0.02M KCl溶液透析至无硫酸铵根离子,获得粗酶液供上柱使用。
…… …… 余下全文